Systematische In-vivo-Proteomikroskopie der co-translationalen Faltung naszierender Ketten durch begrenzte Proteolyse-Massenspektrometrie Massenspektrometrie und selektive Ribosomenprofilierung

• Antragsteller: Mang Zhu, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 549989417

Die Zellen in unserem Körper synthetisieren Proteine mit Hilfe eines großen Enzyms namens Ribosom, indem sie Aminosäuren nacheinander entsprechend der Vorlage des entsprechenden Gens zusammenfügen. Das Ergebnis sind lineare Produkte von Proteinen, die sich zu richtigen 3D-Strukturen falten müssen, um ihre Funktionen in den Zellen zu erfüllen. Die Faltung eines Proteins kann bereits beginnen, wenn es aus dem Ausgangstunnel des Ribosoms austritt, während der Rest desselben Proteins noch synthetisiert wird. Dies wird als co-translationale Faltung der naszierenden Ketten (NC) bezeichnet. Die meisten unserer Erkenntnisse über die NC-Faltung stammen aus Untersuchungen im Reagenzglas, bei denen nur minimale Komponenten aus den Zellen vorhanden sind. Dies hat zwar zu einem entscheidenden Verständnis der NC-Faltung geführt, aber es ist immer noch unklar, wie die Vorgänge wirklich in den Zellen ablaufen, die 1000-mal dichter mit Proteinen gefüllt sind. In dieser Studie soll untersucht werden, wie die NC-Faltung während der Synthese in der Zelle abläuft, indem die Struktur der NC mit einer unspezifischen Proteinase analysiert wird, die vorzugsweise den ungefalteten Bereich der NC verdaut. Die Überreste der NC werden mit einem Massenspektrometer nachgewiesen und liefern uns so den Faltungszustand der NC. Diese Methode wird LiP-MS genannt. Wir werden zunächst die NC-Faltung von Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) untersuchen, einem Modellprotein mit mehreren Unterstrukturen, die gefaltet werden müssen, bevor es seinen endgültig gefalteten Zustand erreicht. Wir werden verschiedene Versionen von Fluc entwickeln, die während der Synthese an verschiedenen Stellen des Proteins am Ribosom blockiert werden. Dadurch werden verschiedene Zustände während der Synthese imitiert und wir können mit Hilfe von LiP-MS verstehen, wie die Faltung während der Proteinsynthese abläuft. Um diese Methode zur Untersuchung der NC-Faltung aller Proteine in der Zelle anzuwenden, müssen wir den Synthesestatus einer bestimmten NC zu einem bestimmten Zeitpunkt kennen. Dazu werden wir den Beginn der Proteinsynthese in der Zelle mit einer Substanz namens Harringtonin synchronisieren und die Synthese nach verschiedenen Zeiträumen mit dem Ribosomeninhibitor Cycloheximid stoppen. Die Menge der in dieser Zeit erfolgten Synthese kann durch Ribosomen-Profiling bestimmt werden und der entsprechende Faltungszustand der NC wird durch LiP-MS ermittelt. Durch die Kombination der beiden Datensätze werden wir in der Lage sein, ein vollständiges Profil der Faltungskinetik jedes in den Zellen nachweisbaren Proteins zu erstellen. Die Regulation des zellulären Niveaus von Chaperonen, einer Gruppe von Proteinen, die die Faltung anderer Proteine unterstützen, ermöglicht uns außerdem einen Einblick in ihren Einfluss auf die NC-Faltung. Mit den Daten der NC-Faltungskinetikprofile werden wir ein maschinelles Lernmodell trainieren, das die Faltungskinetik eines unbekannten Proteins vorhersagen kann.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle