Analyse der Regulation von ATP-abhängigen Lipidtransportern aus dem pathogenen Pilz Cryptococcus neoformans auf Einzelmoleküllevel

• Antragstellerin: Dr. Sarina Veit
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 555663153

Der pathogene Pilz Cryptococcus neoformans verursacht mehr als 100.000 Tode pro Jahr unter immunsupprimierten HIV-Patienten und zusätzlich wurde in letzter Zeit eine steigende Fungizidresistenz beobachtet. Da seine Kapsel ein primärer Virulenzfaktor ist, sind sekretorische Wege essenziell für das Überleben des Pilzes im Wirt und dadurch auch für seine Pathogenität. Für diese Sekretionsmechanismen, vesikulären Transport und Lipidhomöostase spielen Lipidtransporter eine entscheidende Rolle, indem sie den Transport von Lipiden über zelluläre Membranen steuern und eignen sich daher als neue antimykotische Ziele. Mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie wurden kürzlich die Strukturen mehrerer ATP-abhängiger Lipidtransporter aus anderen Organismen aufgeklärt, doch deren funktionelle Charakterisierung bleibt weiterhin eine große Herausforderung. Aktuelle Konzepte legen nahe, dass die Aktivität von Lipidtransportern durch die Zusammensetzung der Lipiddoppelschicht, die Krümmung der Membran und/oder das Membranpotenzial reguliert wird. Direkte experimentelle Beweise für diese Hypothesen fehlen jedoch. Das liegt zum einen daran, dass der Umgang mit integralen Membranproteinen, von der Aufreinigung bis zur Charakterisierung, eine besondere Herausforderung darstellt. Zum anderen werden hochsensitive Analysemethoden benötigt, um Membranproteine auf der molekularen Ebene zu studieren. Unser Ansatz geht dieses Problem von beiden Seiten an, indem wir definierte rekonstituierte Vesikelsysteme auf der Grundlage artifizieller Liposomen und modernste Einzelmolekültechniken einsetzen, um Lipidtransporter der P4-Unterfamilie von ATPasen mit steigender Komplexität der Lipidzusammensetzung zu untersuchen. Die Fluoreszenzmikroskopie an einzelnen Vesikeln kann wertvolle Informationen extrahieren, die in herkömmlichen biochemischen Ensemble-Studien durch die Probenheterogenität verborgen bleiben. Die Vesikel werden immobilisiert und mit einem Hochdurchsatzverfahren mikroskopiert, wodurch Fluoreszenzintensitäten für jedes einzelne Vesikel aufgenommen werden. Die extrahierten Daten können genutzt werden um unter anderem die Größe, Lamellarität, Dichtheit, Proteinverteilung und -orientierung zu messen. Durch das breite Spektrum an räumlichen und zeitlichen Auflösungsmöglichkeiten des Mikroskopaufbaus können Lipidtransportkinetiken von einzelnen Proteinen aufgenommen werden. Wir erwarten, dass unsere Studien Einblicke in (i) die Auswirkung der Lipidzusammensetzung auf die Aktivität von Lipidtransportern und (ii) den zugrundeliegenden Regulationsmechanismen geben. Hier legen wir besonderen Fokus auf die Regulation durch Kinasen und durch Protonengradienten. Alles in allem erlaubt die Kombination von Membranproteinbiochemie und bildgebenden Verfahren wichtige neue Einblicke in die molekularen Eigenschaften, Funktionsmechanismen und die Regulierung von Lipidtransportern, wodurch neue Strategien zur Behandlung von Infektionen mit C. neoformans entwickelt werden können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen