Verständnis und Modulieren des DNA-Targetings von CRISPR-Cas-Effektoren unter Nutzung von ultraschnellen DNA-Entwindungsmessungen

• Antragsteller: Professor Dr. Ralf Seidel
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 568641279

CRISPR-Cas-Effektor-Komplexe, wie Cas9, haben in den letzten Jahren Techniken des Genom-Engineerings grundlegend revolutioniert. Die Herausforderung bei diesen Anwendungen besteht darin, gleichzeitig ein hocheffizientes als auch hochspezifisches DNA-Schneiden zu erreichen. Dieses Projekt zielt darauf ab, die Dynamik der DNA-Targeterkennnung durch Cas9- und Cas12-Effektor-Komplexe auf dem Basenpaar-Niveau aufzulösen, um präzise kinetische Modelle zu entwickeln, die die Eigenschaften der Targeterkennung vorhersagen können. Dafür werden kürzlich entwickelte, ultra­schnelle DNA-Entwindungsmessungen basierend auf einzelnen DNA-Origami-Nanorotoren eingesetzt. Diese Methodik ermöglicht die Echtzeitverfolgung der Expansion und Verkürzung, der durch die Effektoren gebildeten R-loops. Dies erlaubt eine direkte Auflösung kritischer kinetischer Intermediate sowie der Freien-Energie-Landschaft der R-loop-Bildung. Die Studie wird systematisch untersuchen, wie Zwischenzustände und Freie-Energie-Landschaften durch verschiedene Effektor-Varianten und RNA-Sequenzen moduliert werden. Dies wird ein umfassendes Verständnis dafür liefern, wie Protein und die Thermodynamik der RNA-Basenpaarung die Targeterkennung beeinflussen. Die gewonnenen experimentellen Daten werden anschließend genutzt, um kinetische Modelle zu parametrisieren, die die Effizienz und Spezifität der Targetbindung und des DNA-Schneidens durch verschiedene CRISPR-Cas-Effektoren präzise vorhersagen können. Eine Validierung der Modelle soll mittels Vergleich mit verfügbaren Hochdurchsatz-Daten und existierenden Modellen, die die thermodynamischen Beiträge zum Zielfindungsprozess noch nicht berücksichtigen, erfolgen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen