Membranassoziierung, Aufbau und Funktion mitochondrialer Nucleoide
Final Report Abstract
Im DFG-Projekt mit dem Titel: Membranassoziierung, Aufbau und Funktion mitochondrialer Nucleoide wurden, auch als Hilfsmittel für die Analytik mitochondrialer Nucleoide, neue Wege der Gelelektrophorese und der Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie beschritten. Wir haben die Prinzipien für die Bestimmung der Masse von nativen Proteinen mit neuen experimentellen Untersuchungen belegt und stellen allgemeine Regeln für die Massenbestimmung durch BNE auf. Wir demonstrieren die Vorteile der "clearnative" Elektrophorese (CNE) für die Isolierung labiler Membranproteinkomplexe. Die Entwicklung von "large pore" Gelen ermöglicht die Trennung von Megaproteinkomplexen mit Massen von 10-50 MDa, also auch die Isolierung der mitochondrialen Nucleoide aus Rinderherzmitochondrien, wie hier zum ersten Mal gezeigt. Mit einem neuen Isolierungsprotokoll konnten wir zum ersten Mal native mitochondriale Nucleoide aus postmitotischen Zellen (aus Rinderherz) isolieren. Die Cryo-Elektronenmikroskopie zeigte eine native und weitgehend homogene Population von Partikeln mit einer Größe von etwa 100 x 150 nm und einer Masse um 33 MDa. Bei der Masse von 33 MDa dürfte jeder Partikel nur eine einzige doppelsträngige mt-DNA enthalten. Die massenspektrometrisch ermittelte Proteinzusammensetzung der isolierten mt-Nucleoide unterscheidet sich qualitativ und quantitativ völlig von allen bisher beschriebenen Nucleoid-Zusammensetzungen, was dem nativen Zustand der hier isolierten Nucleoide zugeordnet wird. Insgesamt wurden 448 Proteine mit mindestens zwei nicht-redundanten Peptiden identifiziert und die 90 am häufigsten vorkommenden Nucleoid-Proteine nach Fluoreszenzfärbung von 2-D IEF/SDS Gelen densitometrisch ermittelt. Mitochondriale Ribosomen wurden als Hauptkomponenten mitochondrialer Nucleoide identifiziert. Die Häufigkeit mit der Komplexe der oxidativen Phosphorylierung und viele andere Proteine der mitochondrialen Membran als Komponenten von mt-Nucleoiden zu finden sind, spricht für eine ausgeprägte Tendenz der Nucleoide zu einer unspezifischen Bindung an die mitochondriale Innenmembran. Dies lässt eine spezifische Membranverankerung über spezielle Proteine der inneren mitochondrialen Membran als unwahrscheinlich erscheinen.
Publications
- (2010) Assembly and oligomerization of human ATP synthase lacking mitochondrial subunits a and A6L. Biochim. Biophys. Acta 1797, 1004-1011
Wittig, I., Meyer, B., Heide, H., Steger, M., Wumaier, Z., Bleier, L., Karas, M., and Schägger, H.
- (2010) Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue-native electrophoresis: isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics 10, 3379-3387
Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., and Schägger, H.
- (2010) Mass estimation of native proteins by blue-native electrophoresis: principles and practical hints. Mol. Cell. Proteomics 9, 2149-2161
Wittig, I., Beckaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., and Schägger, H.
