Neue Methoden zur Isolierung und massenspektrometrischen Analytik integraler Membranproteine
Final Report Abstract
Ausgangspunkt des Projektes und der Arbeiten war generelle Beobachtung, dass integrale Membranproteine in den typischen Top-down-Proteomics-Ansätzen notorisch unterrepräsentiert sind. Dies kann allerdings nicht ausschließlich mit ihrer Unlöslichkeit in gängigen Lösungsmitteln und somit Verlusten in der Aufarbeitung der Probe erklärt werden, sondern ist auch bedingt durch Probleme, die sich auf Grund des nahezu universell genutzten Verdauenzyms Trypsin ergeben, da gerade in den hydrophoben Transmembranhelizes große Bereich existieren, die wenige oder gar keine Schnittstellen aufweisen. Das Hauptziel dieses Antrags war die Fortsetzung der Arbeiten zur Entwicklung und Optimierung neuer Methoden zur massenspektrometrischen Analyse integraler Membranproteine über methodische Verbesserungen der Erzeugung, Extraktion und Identifizierung (hydrophober) Peptide. In den Mittelpunkt der Arbeiten rückte nach ausführlichen Vorexperimenten zu den Enzymen Chymotrypsin und Pepsin das Enzym Elastase, das sich nach der Ausarbeitung eines adaptierten Protokolls trotz seiner sehr breiten Schnittspezifität als universell geeignet erwies. So ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Der Nachweis mittels MALDI-Ionisation wurde durch den Einsatz der neuen Matrix-Klasse der Halogen-Cyanozimtsäuren deutlich verbessert. Die für Elastase-Verdaus erforderliche hohe Massengenauigkeit und Generierung von MS/MS-Daten wurde durch den kombinierten Einsatz zweier Instrumente erhalten – eines MALDI-TOF/TOF und der MALDI-Orbitrap. Leider gab es allerdings auch einen deutlichen wissenschaftlichen Fehlschlag. Trotz wiederholter Versuche gelang es nicht, den Ansatz – das Herausschneiden der Membransegmente von Membranproteinen aus intakten Lipidpartkel – auch nur ansatzweise und an Modellsystemen zu realisieren. Nach zahlreichen Versuchen wurde dieses attraktive Konzept nicht weiter verfolgt. Stattdessen wurden intensive Arbeiten aufgenommen, die Ausbeute von In-gel-Verdaus zu verbessern und so der begrenzten Nachweisempfindlichkeit entgegen zu wirken. Es wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Nach der Proteintrennung wird das Gel partiell angelöst. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren MS-Ergebnissen. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Abgesehen von oben angesprochenen Fehlschlag ist es im Rahmen dieses Projektes gelungen, die Proteomics-Methodik für Membranproteine methodisch veranzubringen. Dies mag man auch daran erkennen, dass die im Rahmen des Projektes erzielten Ergebnisse nicht nur (hochwertig) publiziert wurden, sondern auch in die Laborroutine der Arbeitsgruppe eingeflossen sind, in folgenden Kooperationsprojekten genutzt wurden, oder auch Ausgangspunkt für weitere Arbeiten innerhalb der Arbeitsgruppe geworden sind und zu den unten aufgeführten Folgepublikationen geführt haben.
Publications
- (2008) An alternative method for investigation of whole membrane samples using elastase as digestive protease. Poster : 56. ASMS Jahrestagung, 01. Juni – 05. Juni 2008, Denver CO
Rietschel B., Arrey T.N., Meyer B., Karas M., Poetsch A.
- A new polyacrylamide gel system based on an alternative crosslinker for proteomic research 56. ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 01. – 05. Juni 2008, Denver CO
Bornemann S, Karas M
- A novel proteolytic treatment capable of digesting transmembrane proteins in presence of strong anionic detergent. Poster : 56. ASMS Jahrestagung, 01. Juni – 05. Juni 2008, Denver CO
Schürken M, Karas M
- A comprehensive software tool for proteomics data generated by less specific enzymes Poster : 57. ASMS Jahrestagung 31. Mai – 04. Juni 2009, Philadelphia PA (2009)
Schürken M, Karas M
- Analysis of membrane complex „NADH:Ubiquinone oxidoreductase“ of Aquifex aeolicus. 42. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, 08. – 11.März 2009, Konstanz
Bornemann S, Peng G, Hedderich T, Michel H, Karas M
- Approaching the complexity of membrane proteomes digested with elastase using off-gel IEF/nanoLC-MALDI-MS/MS. Poster : 57. ASMS Jahrestagung 31. Mai – 04. Juni 2009, Philadelphia PA (2009)
Rietschel B., Arrey T.N., Bornemann S., Meyer B., Papasotiriou D., Poetsch A., Karas M.
- Elastase digests: New ammunition for shotgun membrane proteomics Mol.Cell. Proteomics 8 (2009)1029-43
Rietschel B, Arrey TN, Meyer B, Bornemann S, Schürken M, Karas M, Poetsch A
- Elastase- an optimal protease for membrane shotgun proteomics. Poster : 42. DGMS Jahrestagung. 08. März – 11.März 2009, Konstanz
Rietschel B., Arrey T.N., Meyer B., Bornemann S., Poetsch A., Karas M
- Membrane Protein Analysis Using an Improved Peptic in-solution Digestion Protocol. Proteomics 9 (2009) 5553-5557
Rietschel B, Bornemann S, Arrey TN, Bäumlisberger D, Karas M, Meyer B
- A novel polyacrylamide gel system for proteomic use offering controllable pore expansion by crosslinker cleavage. Electrophoresis 31 (2010) 585–592
Bornemann S, Rietschel B, Baltruschat S, Karas M, Meyer B
- Approaching the Complexity of Elastase-Digested Membrane Proteomes Using Off-Gel IEF/ nLC-MALDI-MS/MS. Anal. Chem. 82 (2010) 2145–49
Arrey TN, Rietschel B, Papasotiriou DG, Bornemann S, Baeumlisberger D, Karas M, Meyer B
- Labeling elastase digests with TMT: informational gain by identification of poorly detectable peptides with MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Proteomics 10 (2010) 3905-9
Baeumlisberger D, Arrey TN, Rietschel B, Rohmer M, Papasotiriou DG, Mueller B, Beckhaus T, Karas M
- Simple dual-spotting procedure enhances nLC-MALDI MS/MS analysis of digests with less specific enzymes. J Proteome Res10 ( 2011) 89-94
Baeumlisberger D, Rohmer M, Arrey TN, Mueller BF, Beckhaus T, Bahr U, Barka G, Karas M
