Entwicklung von GPCR-Phosphorylierungsassays mit mittlerem bis hohem Durchsatz für das Sekundärscreening von Liganden und GRK-Inhibitoren

• Antragsteller: Professor Dr. Carsten Hoffmann; Professor Dr. Stefan Schulz
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Pharmazie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 569850315

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind wichtige pharmakologische Zielstrukturen für viele menschliche Krankheiten. Die Aktivierung durch Agonisten führt zu Konformationsänderungen, die von einer Familie von GPCR-Kinasen (GRKs) erkannt werden. Die einzigartige Fähigkeit der GRKs, aktivierte Rezeptoren zu erkennen, führt zu agonist-abhängiger Phosphorylierung an intrazellulären Serin- und Threoninresten. Wir haben kürzlich einen quantitativen GPCR-Phosphorylierungsassay entwickelt, der vollständig in einem Multi-Well-Format durchgeführt werden kann, so dass keine Western-Blot-Analyse erforderlich ist. Es ist uns auch gelungen, elf kombinatorische HEK293-Knockout-Zellklone zu erzeugen, denen GRK2/3/5/6 fehlt, darunter ein einfacher, doppelter, dreifacher und vierfacher GRK-Knockout. Eine offensichtliche Einschränkung unseres neuen Assays ist, dass noch nicht für alle GPCRs phosphostellen-spezifische Antikörper verfügbar sind. Die 7TM Antibodies GmbH wurde eigens gegründet, um diese Lücke zu schließen. Somit ist die 7TM Antibodies GmbH der ideale Anwendungspartner für dieses Projekt. In diesem Projekt werden wir ein Konsortium bilden, zu dem der akademische Partner 1 neuartige GPCR-Phosphorylierungs-Assay-Technologien, der akademische Partner 2 eine kombinatorische Bibliothek von GPCR-Kinase- und Phosphatase-Knockout-Zellen und der Anwendungspartner eine breite Palette von validierten phosphostellen-spezifischen GPCR-Antikörpern beisteuern wird. Nur diese einzigartige Kombination von Partnern wird es uns ermöglichen, prototypische Assay-Anwendungen zu entwickeln, die die Identifizierung von GPCR Kinasen und Phosphatasen ermöglichen werden. Es wird auch die Entwicklung von prototypischen Assays für die Erstellung von Ligandenprofilen, das Screening von GRK-Inhibitoren und die Analyse von Orphan-GPCRs angestrebt. Konkret will das Konsortium (1) die GRK-Spezifität der GPCR-Phosphorylierung aufklären, (2) selektive zelluläre Inhibitor-Assays für einzelne GRKs entwickeln, (3) die GPCR-Dephosphorylierung durch die Schaffung von CRISPR/Cas9-Proteinphosphatase-Knockout-Zellen aufklären, (4) GPCR-Phosphorylierungsassays für atypische 7TM-Rezeptoren entwickeln, (5) GPCR-Phosphorylierungsassays für Orphan 7TM-Rezeptoren etablieren und (6) homogene NanoBRET-basierter GPCR-Phosphorylierungsassays der zweiten Generation entwickeln. Die hier beschriebenen Arbeiten werden nicht nur den Wissenstransfer erleichtern, sondern auch zur Beantwortung grundlegender Fragen in der GPCR-Grundlagenforschung beitragen. Für eine breite Anwendung in der akademischen und pharmazeutischen Forschung ist es jedoch notwendig, diese neuartige Technologie an das 384-Well-Format zu skalieren und monoklonale GPCR-Antikörper herzustellen. Es wird davon ausgegangen, dass diese methodische Entwicklung vom Anwendungspartner nach Abschluss dieses Projekts durchgeführt wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen (Transferprojekt)
• Anwendungspartner: 7TM Antibodies GmbH