DARPins als Werkzeuge für die Untersuchung von Interaktomen und für die Markierung in Langzeit Fluoreszenzmikroskopie Untersuchungen in lebender Zellen

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch; Professor Dr. Mike Heilemann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 573586139

Designed Ankyrin-Repeat-Proteins – DARPins – können als hochselektive Bindungsmodule hergestellt werden, die im Prinzip an jede gefaltete Proteindomäne binden können. Sie bestehen aus 1 bis 3 internen Modulen, die jeweils zwei α-Helices umfassen, die durch eine Schleife verbunden sind. Ein N-terminales und ein C-terminales Modul sorgen für eine hohe Stabilität dieser Proteine. In jedem internen Modul können 6 Positionen in der Schleife, aber auch einige in den Helices randomisiert werden, um eine große Bibliothek verschiedener DARPins zu erstellen. Diejenigen, die mit hoher Affinität an eine bestimmte Zieldomäne binden, können aus diesem Pool mithilfe von Ribosom- und Phagen-Display-Techniken ausgewählt werden. Die geringe Größe von DARPins und das Fehlen von Disulfidbrücken machen sie ideal geeignet als Bindungsmodule in der reduzierenden Umgebung lebender Zellen. Ihre hohe Affinität und Selektivität kann genutzt werden, um enzymatische Funktionen an ausgewählte Zielproteine zu bringen. Solche enzymatischen Funktionen können beispielsweise E3-Ligasen sein, wodurch BioPROTACS entwickelt werden können. Hier schlagen wir vor, Protokolle für die Kombination von DARPins mit Biotinligasen zu entwickeln, um das Interaktom von Zielproteinen zu untersuchen. Durch die Verwendung der DARPins, um die Biotinligase zum Zielprotein zu leiten, entfällt die Notwendigkeit einer genetischen Manipulation der Zellen durch direkte Fusion der Biotinligase mit dem Zielprotein, wodurch die Untersuchung von Interaktomen auch in Primärzellen ermöglicht wird. Die Verwendung von Massenspektrometrie nach Beginn der Biotinylierung ermöglicht die Identifizierung des Interaktoms. In ähnlicher Weise schlagen wir vor, die DARPins mit modifizierten Halo-Tags zu fusionieren, die nicht-kovalent an Liganden binden. Durch den Austausch der Fluoreszenzmarker kann das Problem des Photobleachings in Live-Cell-Imaging-Experimenten gelöst werden. Auch hier ist keine genetische Manipulation der untersuchten Zellen erforderlich, um die Lokalisierung des interessierenden Proteins sichtbar zu machen. In beiden Anwendungen wird die mRNA der DARPin-Fusionsproteine unter Verwendung von Transfektionslipiden in die Zellen transfiziert. Wir werden diese Methoden mit zwei verschiedenen Isoformen von p63 entwickeln, die unterschiedliche biologische Rollen bei der Aufrechterhaltung des basalen Kompartiments von Epithelgeweben und bei der genetischen Qualitätskontrolle in Eizellen spielen. Während diese Methoden mit Modellzelllinien entwickelt werden, planen wir für die Zukunft, diese Methoden in den relevanten Epithelzellen und Eizellen einzusetzen, um das Interaktom und die Lokalisierung von p63 zu charakterisieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen