Escherichia coli Cytochrom bd-II: eine energiewandelnde Chinolperoxidase

• Antragsteller: Professor Dr. Thorsten Friedrich
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 577813180

Cytochrom-bd Enzymkomplexe sind Teil der Atmungsketten von Bakterien und Archaeen. Mitglieder dieser Enzymfamilie kommen in Eukaryoten nicht vor, was sie zu einem vielversprechenden therapeutischen Ziel für Antibiotika macht. Es ist bekannt, dass Cytochrom bd die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser und die Oxidation von Chinolen katalysiert. Das Enzym trägt zur Erzeugung der Protonenmotorischen Kraft (pmf) bei, indem es Protonen der Chinoloxidation nach außen abgibt und Protonen für die Sauerstoffreduktion aus der Zelle aufnimmt. Darüber hinaus hat Cytochrom bd verschiedene andere Funktionen: Es schützt sauerstofflabile Proteine, Zellen vor Hitzestress und anderen Umweltstress-Faktoren und es ist Teil der bakteriellen Abwehrmechanismen gegen antibiotikainduzierten Stress. Escherichia coli enthält zwei sehr ähnliche Isoformen namens Cytochrom bd-I und Cytochrom bd-II. Es wird angenommen, dass sie ähnliche Funktionen haben und deswegen austauschbar sein könnten. Die entsprechenden Gene werden jedoch unterschiedlich exprimiert, und es gibt geringfügige strukturelle und funktionelle Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Daher bleibt die physiologische Rolle von Cytochrom bd-II ebenso unklar wie seine Eignung als Ziel für antimikrobielle Wirkstoffe. Erste Experimente zeigen, dass Cytochrom bd-II eine geringe Chinoloxidase-, aber eine hohe Chinolperoxidase-Aktivität aufweist. Entsprechend seiner Architektur könnte der Komplex eine neuartige energiewandelnde Chinolperoxidase-Aktivität zeigen. In diesem Projekt werden wir die Steady-State-Kinetik der Chinoloxidase- und der Chinolperoxidase-Reaktion von Cytochrom bd-II unter anoxischen Bedingungen bestimmen. Die Spezifitätskonstante beider Reaktionen wird Aufschluss darüber geben, ob es sich bei dem nativen Enzym um eine Oxidase oder eine Peroxidase handelt. Wir werden eine Kombination aus He-Temperatur-EPR-, Stopped-Flow-UV/Vis-, FTIR- und Raman-Spektroskopie verwenden, um Intermediate der Oxidase- und der Peroxidase-Reaktion zu identifizieren. Die Spektren werden mit denen verglichen, die unter identischen Bedingungen mit Cytochrom bd-I erhalten wurden. Die Struktur beider Komplexe wird mittels kryogener Elektronenmikroskopie bestimmt. Die Proben werden unter anaeroben Bedingungen vorbereitet und mit verschiedenen Chinolen, Wasserstoffperoxid und verschiedenen Mischungen davon inkubiert. Aus diesen Daten wird ein Mechanismus der Peroxidase-Reaktion abgeleitet werden. Wir werden Cytochrom bd-II in Liposomen rekonstituieren und einen Protonengradienten über die Proteoliposomen mithilfe optischer Farbstoffe messen. Die eingeschränkte Permeabilität von Wasserstoffperoxid über die Membran wird dazu beitragen, einen transienten Gradienten in Stopped-Flow Messungen zu erkennen. Alle Experimente werden in hohem Maße von der Verwendung von etwa 50 verschiedenen ortsspezifischen Cytochrom-bd-I und bd-II Mutanten profitieren, die von unserer Gruppe erzeugt wurden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen