Selektive Detektion der partiell gefalteten DNA Bindungsdomäne in mutiertem p53 und p53 Isoformen mit Hilfe von DARPins.

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 580056875

Wir haben Designed Ankyrin Repeat Proteine – DARPins – als hochaffine und hochselektive Bindungsmodule für alle gefalteten Domänen der Mitglieder der p53-Proteinfamilie (p53, p63, p73) entwickelt. DARPins bestehen aus 1 bis 3 internen Modulen, die jeweils zwei α-Helices umfassen, die durch eine Schleife verbunden sind. In jedem internen Modul können 6 Positionen in der Schleife randomisiert werden, um eine große Bibliothek verschiedener DARPins zu erstellen. Diejenigen, die fest an eine bestimmte Zieldomäne binden, können aus diesem Pool mit Hilfe von Ribosom-Display-Techniken ausgewählt werden. Da DARPins keine Cysteine enthalten, hängt ihre Stabilität nicht von Disulfidbrücken ab, wodurch sie sich ideal als Inhibitoren/Bindungsmodule in der reduzierenden intrazellulären Umgebung eignen. Bei der Suche nach DARPins, die an alle gefalteten Domänen der p53-Proteinfamilie binden, haben wir ein DARPin (C10) identifiziert, das an die p53-DBD bindet. Die Bindung dieses DARPin C10 kann viele inaktivierte p53-Mutationen, die in Tumoren gefunden werden, stabilisieren. Mit einer Schmelztemperatur von ~43 °C liegt die thermodynamische Stabilität der DBD von p53 nur geringfügig über der Körpertemperatur von 37 °C. Folglich führen viele Mutationen im Kern des Proteins zu einer Destabilisierung und Entfaltung bei physiologischer Temperatur. Bis zu einem Drittel aller krebsbezogenen p53-Mutationen gelten als temperatursensitiv, und unsere Daten haben gezeigt, dass wir viele davon mit dem DARPin C10 reaktivieren können. Einige Kategorien von Mutationen können jedoch nicht durch unseren DARPin C10 reaktiviert werden: Dazu gehören Mutationen, die zum Verlust des essenziellen Zn-Ions führen oder andere lokale Konformationen erzeugen, die nicht dem Wildtyp entsprechen. Wir haben nun ein DARPin (C6) identifiziert, das selektiv an diese fehlgefalteten p53-Mutanten bindet, wie beispielsweise die p53-R175H-Mutante. Wir konnten zeigen, dass es nicht an ein lineares Epitop bindet, sondern an eine fehlgefaltete Konformation, die von unserem DARPin C10, das an die gefaltete DBD bindet, nicht erkannt wird. Wir konnten weiter zeigen, dass das DARPin C6 an das E3-Adapterprotein SPOP fusioniert werden kann, wodurch die p53-Mutante selektiv abgebaut wird, während das Wildtyp-p53 nicht beeinträchtigt wird. Hier schlagen wir vor, NMR-Spektroskopie zu verwenden, um das genaue Bindungs-Epitop dieses DARPin C6 zu identifizieren und zu bewerten, ob in Mauszellen, die die destabilisierte R172H-Mutante und Wildtyp-p53 exprimieren, ein p53-abhängiges Transkriptionsprogramm auf der Grundlage des Abbaus des mutierten p53 wiederhergestellt werden kann. Wir beschreiben außerdem Experimente, bei denen diese Degradationsfunktion genutzt wird, um destabilisierte p53-Isoformen selektiv abzubauen und dieses DARPin C6 in ein antikörperähnliches Molekül umzuwandeln, mit dem mutiertes p53 und p53-Isoformen in Zellkulturen und Material von menschlichen Patienten nachgewiesen werden können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Türkei
• Partnerorganisation: TÜBITAK The Scientific and Technology Research Council of Turkey
• Kooperationspartner: Professor Dr. Cagdas Dag