Biosynthese von Isoprenoiden: Mechanistische Untersuchungen, Enzym-Engineering und enzymatische Synthese neuartiger Terpenanaloga

• Antragsteller: Professor Dr. Jeroen Dickschat
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 584969299

Dieses Projekt befasst sich mit den Enzymmechanismen dreier Terpensynthasen (TS), deren Produktstrukturen und Biosynthesevorschläge kürzlich veröffentlicht wurden. Eine detaillierte Analyse der vorgeschlagenen Mechanismen deckte in einem Fall offene stereochemische Fragen und in zwei Fällen alternative Möglichkeiten auf. Experimentelle Arbeiten zur Aufklärung der Mechanismen umfassen umfangreiche Isotopenmarkierungsexperimente in Kombination mit DFT-Rechnungen in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Bernd Goldfuss (Universität zu Köln). Aus unseren vorherigen Arbeiten steht eine große Bibliothek markierter Terpenvorstufen zur Verfügung; im Rahmen dieses Projekts werden neu designte Vorstufen mit speziellen Isotopensubstitutionen synthetisiert. Die Mechanismen der drei publizierten Enzyme werden mittels gezielter Mutagenese von Aminosäureresten im aktiven Zentrum weiter untersucht. Diese können zunächst anhand von Alphafold-3-Proteinmodellen identifiziert werden. Für tiefergehende Einblicke werden jedoch Enzymkristallstrukturen, idealerweise mit Metall-Cofaktoren und synthetischen, nicht-reaktiven Substrat-Surrogaten ligandiert, in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Michael Groll (TU München) gewonnen. Produktive Varianten von VniA werden zusammen mit dem CYP450 aus demselben Biosynthese-Gencluster, das an der Vinigrol-Biosynthese beteiligt ist, heterolog in A. oryzae exprimiert, was potenziell zur Gewinnung neuer bioaktiver Derivate führen kann. Substratanaloga mit blockierter (Doppelbindungssättigung) oder gepufferter (Abspaltung von Methylgruppen) Reaktivität werden ebenfalls zur Untersuchung der Mechanismen der drei Enzyme eingesetzt. Es wird erwartet, dass solche Substratanaloga zur Bildung von Abgangsprodukten führen, die kationische Zwischenprodukte entlang der Cyclisierungskaskade darstellen und somit deren Existenz belegen. Alle neu erhaltenen Produkte von Enzymvarianten oder Substratanaloga mit blockierter/gepufferter Reaktivität werden isoliert und bis zur Bestimmung der absoluten Konfiguration strukturell charakterisiert. Neue Substratanaloga mit funktionellen Gruppen, die zu veränderten Reaktivitäten führen können, werden synthetisiert und mit allen untersuchten Übergangszuständen umgesetzt. Dies umfasst Substratanaloga mit Alkinfunktion und Cyclopropanringen. Falls beispielsweise die sterische Hinderung durch das zusätzliche Kohlenstoffatom des Cyclopropanrings nicht toleriert wird, werden strukturbasierte Enzymvarianten mit erweiterter Kavität hergestellt. Sollten die Enzyme im Fokus dieses Projekts mit Substratanaloga eine unzureichende Aktivität zeigen, werden die synthetischen Verbindungen mit anderen, in früheren Arbeiten bereitgestellten Übergangszuständen getestet. Alle Produkte werden isoliert und ihre Strukturen vollständig aufgeklärt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen