Generierung und Charakterisierung einer knock-in Maus, die BDNF-YFP unter Kontrolle der endogenen regulatorischen Elemente des BDNF-Gens exprimiert
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ist ein in Vesikeln gespeichertes neuronales Protein und ein wichtiger Regulator der synaptischen Übertragung im Säugetier-Gehirn. BDNF wird bei starker synaptischer Aktivität aus Vesikeln an erregenden Synapsen ausgeschüttet und ermöglicht über spezifische Zellmembran-Rezeptoren (TrkB, p75) langanhaltende Veränderungen in prä- und postsynaptischen Neuronen, die Lern- und Gedächtnisvorgängen im Gehirn zugrunde liegen. Angesichts der Tatsache, dass die verminderte (synaptische) Verfügbarkeit und Wirkung von BDNF als mögliche Ursache vieler neurodegenerativer Erkrankungen (Morbus Huntington, Morbus Alzheimer und andere Formen der Demenz) und neurologischer Erkrankungen (Depression, Schizophrenie, Essstörungen) angesehen wird, ist eine zeitlich und örtlich aufgelöste Analyse der zellulären Synthese, Sekretion und Wirkung von BDNF von kaum zu überschätzender Bedeutung. Das äußerst geringe Expressions-Niveau des endogenen BDNF in vivo und das Fehlen ausreichend spezifischer und dabei gleichzeitig sensitiver BDNF-Antikörper hat dazu geführt, dass die genaue axonale (und damit präsynaptische) und dendritische (und damit postsynaptische) Verteilung von BDNF in verschiedenen Hirnregionen nur unzureichend verstanden ist. Im Rahmen des Projektes gelang es nun, ein Mausmodell (Knockin-Maus für BDNF-EGFP; KiBE- Maus) zu entwickeln, das intrinsisch fluoreszierendes BDNF-GFP anstatt wildtypischem BDNF unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Elemente des BDNF-Gens exprimiert. Die Maus erlaubt es, die Verteilung, den Transport und die Ausschüttung von BDNF-GFP in fixiertem Gewebe aber auch in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu beobachten. Da BDNF essentiell für das Überleben von Mäusen ist, war es zunächst nicht selbstverständlich, dass das GFP-markierte BDNF dieselbe biologische Funktion wie das Wildtyp-BDNF aufweisen würde. Unsere Untersuchungen zeigen jetzt, dass auch homozygote KiBE-Mäuse, die über kein Wildtyp- BDNF mehr verfügen, genauso gut überleben wie ihre Wildtyp-Geschwister. Die durch die GFP-Markierung mögliche Untersuchung der Verteilung von BDNF-GFP zeigt außerdem dieselbe Verteilung des BDNF-GFP, wie sie in früheren Studien für endogenes BDNF beschrieben wurde. In lebenden Hirnschnitten und kultivierten Neuronen der KiBE-Mäuse zeigen unsere bisherigen Untersuchungen eine Sekretion von BDNF-GFP aus den Speichervesikeln mit denselben Eigenschaften, wie sie für künstlich überexprimiertes BDNF-GFP von uns und anderen bereits früher in Neuronen des Hippocampus gezeigt werden konnte. Das KiBE-Mausmodell kann nun in Zukunft verwendet werden, um die Dynamik von BDNF-Vesikeln in den Zellen und der BDNF-Ausschüttung aus den Neuronen zeitaufgelöst zu untersuchen, ohne durch Transfektionen zunächst ein unphysiologisch hohes Expressions-Niveau des Proteins herbeizuführen. Durch Kreuzung dieser Mäuse mit Mausmodellen für die o.g. Erkrankungen kann das Gewebe der Tiere hinsichtlich Veränderungen der BDNF-Dynamik untersucht werden und so wertvolle Hinweise auf die Beteiligung eines gestörten BDNF-Stoffwechsels bei neurodegenerativen und neurologischen Erkrankungen liefern. Überraschend war für uns, dass die physiologisch niedrige Expression des BDNF-GFP in den KiBE-Mäusen zu einer mindestens 10-fach reduzierten Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Vesikel im Vergleich zur Überexpression mit BDNF-GFP-Plasmiden führte, obwohl z.B. die Größe und die Dichte der Vesikel unter beiden Bedingungen vergleichbar sind. Diese schwache Fluoreszenz der BDNF- GFP-Vesikel bringt das GFP-Signal nur knapp über die unspezifische grüne Hintergrund-Fluoreszenz, die durch natürlich vorkommende, zelleigene Fluorophore (z.B. NADH, FADH, Lipofuscin, Riboflavine) hervorgerufen wird. Vor diesem Fluoreszenz-Hintergrund lässt sich das spezifische GFP-Signal nur mit dem sog. Spectral unmixing-Verfahren eines Zeiss LSM 780 Konfokal-Mikroskops detektieren. Interessanterweise nimmt die Menge an BDNF-GFP pro Vesikel und damit die Fluoreszenzintensität der Vesikel durch physiologische Stimuli, die für eine BDNF-Proteinexpressions-Steigerung bekannt sind (z.B. starke elektrische Aktivität der Neurone) stark zu und erleichtert damit die Bildgebung der Vesikel.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) BDNF signaling in the formation, maturation and plasticity of glutamatergic and GABAergic synapses. Exp Brain Res 199:203-234
Gottmann K, Mittmann T, Lessmann V
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(2009) Mechanisms, locations, and kinetics of synaptic BDNF secretion: an update. Neurosci Res 65:11-22
Lessmann V, Brigadski T
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(2012) Impaired transmission at corticothalamic excitatory inputs and intrathalamic GABAergic synapses in the ventrobasal thalamus of heterozygous BDNF knockout mice. Neuroscience 222: 215-227
Laudes T, Meis S, Munsch T, Lessmann V
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(2013) Acute and chronic interference with BDNF/TrkB-signaling impair LTP selectively at mossy fiber synapses in the CA3 region of mouse hippocampus. Neuropharmacology 71:247-254
Schildt S, Endres T, Lessmann V, and Edelmann E
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(2013) Embryonic stem cells stably expressing BDNF-GFP exhibit a BDNF releasedependent enhancement of neuronal differentiation. J.Cell Sci 126 (Pt 21): 5062-73
Leschik J, Eckenstaler R, Nieweg K, Lichtenecker P, Brigadski T, Gottmann K, Lessmann V, and Lutz B
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(2013) Single-cell juxtacellular transfection and recording technique. Pfluegers Arch 465(11):1637-49
Daniel J, Polder H R, Lessmann V, Brigadski T
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(2014) BDNF-induced nitric oxide signals in cultured rat hippocampal neurons: time course, mechanism of generation, and effect on neurotrophin secretion. Front Cell Neurosci. 8:323
Kolarow R, Kuhlmann CR, Munsch T, Zehendner C, Brigadski T, Luhmann HJ, Lessmann V
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(2014) BDNF: A regulator of learning and memory with clinical relevance. e-Neuroforum. 03/2014; 5(1):1-11
Brigadski T, Lessmann V
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(2015) Theta burst firing recruits BDNF release and signaling in postsynaptic CA1 neurons in spike timing-dependent LTP. Neuron 86(4):1041-54
Edelmann E, Cepeda-Prado E, Franck M, Lichtenecker P, Brigadski T, Lessmann V
