Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die super-auflösende Fluoreszenzmikroskopie, also Verfahren zur Überwindung des Abbe’schen Beugungslimits, ist eine der zentralen Entwicklungen auf dem Gebiet der optischen Mikroskopie der letzten Jahre. Bereits vor Antragstellung waren einige Konzepte etabliert, die durch Verringerung der Größe des fokalen Spots oder durch die sukzessive Lokalisation einzelner Moleküle das Beugungslimit überwinden konnten. Für letztere Verfahren sind insbesondere neue und bessere Möglichkeiten, einzelne Farbstoffmoleküle AN- und AUS- zu schalten von zentraler Bedeutung. Das Großgerät vereinigt die für die Superauflösungsmikroskopie nötigen Fähigkeiten z.B. des Weitfeld- Imagings mit der konfokalen Einzelmolekülmikroskopie, mit der neue Schaltmoleküle und Schaltmechanismen erforscht werden können. Es ist in dieser Hinsicht einmalig und war mit diesen Funktionen nicht kommerziell erhältlich. Daher wurde diese Apparatur aus Einzelkomponenten selbst gebaut und mit Hilfe von LabView entwickelter Software angesteuert. Die Forschungsprojekte an dieser Apparatur beinhalten insbesondere die Entwicklung neuer, superauflösender Fluoreszenzmikroskopie sowie geeigneter Farbstoffe und Schaltmechanismen als auch die Anwendung auf biologische und nanotechnologische Fragestellungen. Zunächst gelang es uns, die kurz zuvor erreichte Kontrolle des Blinkens einzelner Moleküle für die Superauflösungsmikroskopie zu nutzen. Dabei dienen durch einfachen Elektronentransfer induzierte Radikal-Anionen als Auszustände, um die stochastisch im AN-Zustand verbliebenen weit verteilten Moleküle nanometergenau zu lokalisieren. Durch stochastisches Wechseln der Populationen im AN- und AUS-Zustand kann so sukzessive ein superaufgelöstes Bild rekonstruiert werden. Da dieser Ansatz generische Auszustände quasi aller Farbstoffe ausnutzt, ist er verbreitet anwendbar und wurde Blink- Mikroskopie genannt. Im Folgenden gelang uns durch Benutzung besonders elektronenaffiner Farbstoffe das dauerhafte Ausschalten einzelner Moleküle sowie die Blink- Mikroskopie auch in Anwesenheit von Sauerstoff. Bei der Erweiterung der Farbstoffpalette und der Demonstration des ROXS – Konzepts (reducing and oxidizing system) zeigten wird die Anwendbarkeit von Perylen-Diimid- Derivaten in verschiedenen Lösungsmitteln (Kooperation mit K. Müllen / A. Herrmann). Im Zeitalter der aufregenden Entwicklungen immer neuer Superauflösungsmikroskopie-Techniken bedarf es Proben, die reproduzierbar und verlässlich das Auflösungsvermögen einer Technik und die Funktionsfähigkeit eines Mikroskops darstellen können. In diesem Zusammenhang gelang mit Hilfe der DNA Nanotechnologie (DNA-Origami Technik) die Herstellung von Proben mit einer frei einstellbaren Anzahl von Farbstoffmolekülen im Bereich von 2 – 300 nm. Wir konnten zeigen, dass diese Proben in hoher Ausbeute hergestellt werden und mit Hilfe verschiedener Techniken aufgelöst werden können. Außerdem erweiterten wir den Pool superauflösender Techniken, indem wir das AN- und AB-binden kurzer DNA Stücke an eine aufzulösende Struktur für die notwendige kleine Dichte aktiver Farbstoffmoleküle nutzten. Diese DNA-PAINT genannte Technik hat den Vorteil, nicht durch Photobleichen limitiert zu sein, da sich die Farbstoffe immer wieder erneuern (Kooperation mit F.C. Simmel). Schließlich wurden die auf dem Forschungsgroßgerät entwickelten Techniken angewendet, um DNA Nanostrukturen, mit Hilfe von Einzelmolekülassemblierung hergestellte Strukturen („single-molecule-cut-and-paste“) als auch Proteincluster in Zellmembranen superaufgelöst abzubilden (Kooperationen mit L. Schermelleh, T. Liedl, H. Gaub). Zum Beispiel konnte die Kolokalisation verschiedener C-type Lectine in den Membranen dendritischer Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden (Kooperation mit K. Jacobson).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Superresolution Microscopy on the Basis of Engineered Dark States. J. Am. Chem. Soc. 130, 16840-16841, 2008
C. Steinhauer, C. Forthmann, J. Vogelsang, P. Tinnefeld
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Controlling the Fluorescence of Ordinary Oxazine Dyes for Single-Molecule Switching and Superresolution Microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 20, 8107-8112, 2009
J. Vogelsang, T. Cordes, C. Steinhauer, C. Forthmann, P. Tinnefeld
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DNA Origami as Nanoscopic Ruler for Superresolution Microscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8870-8873, 2009
C. Steinhauer, R. Jungmann, T.L. Sobey, F.C. Simmel, P. Tinnefeld
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Single-Molecule Photophysics of Oxazines on DNA and its application in a FRET switch. Photochem. & Photobiol. Sci. 8, 486-496, 2009
J. Vogelsang, T. Cordes, P. Tinnefeld
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Nano Lett. 10, 645-651, 2010
T. Cordes, M. Strackharn, S.W. Stahl, W. Summerer, C. Steinhauer, C. Forthmann, E. Puchner, J. Vogelsang, H.E. Gaub, P. Tinnefeld
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Single-Molecule Kinetics and Super-Resolution Microscopy by Fluorescence Imaging of Transient Binding on DNA Origami. Nano Lett. 10, 4756-4761, 2010
R. Jungmann, C. Steinhauer, M. Scheible, A. Kuzyk, P. Tinnefeld, F.C. Simmel
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Single-Molecule Redox Blinking of Perylene Diimide Derivatives in Water. J. Am. Chem. Soc. 132, 2404-2409, 2010
T. Cordes, J. Vogelsang, M. Anaya, C. Spagnuolo, A. Gietl, W. Summerer, A. Herrmann, K. Müllen, P. Tinnefeld
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A Structurally Variable Hinged Tetrahedron Framework from DNA Origami. J. Nucl. Ac. 2011, Article ID 360954, 9 pages, 2011
D.M. Smith, V. Schüller, C. Forthmann, R. Schreiber, P. Tinnefeld, T. Liedl
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Mechanism and Advancement of Antifading Agents for Confocal Microscopy. PhysChemChemPhys 13, 6699-6709, 2011
T. Cordes, A. Maiser, C. Steinhauer, L. Schermelleh, P. Tinnefeld
