Development of high-yield in vitro and in vivo protein expression systems based on Leishmania tarentolae

• Antragsteller: Dr. Kirill Alexandrov
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2008 bis 2011
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 62297779

Trotz ihrer mehr als 30 Jahre langen Geschichte bleibt die Produktion von eukaryotischer Proteine in rekombinanter Form problematisch. Dies ist zu einem großen Anteil auf die Tatsache zurückzuführen, dass alle verfügbaren eukaryotischen Proteinexpressionssysteme die endogene und stark regulierte RNA Polymerase II benutzen. Die Komplexität der Transkriptionskontrollmaschinerie macht die Konstruktion von Eukaryoten, die große Mengen an rekombinanten Polypeptiden in reproduzierbarer Weise herstellen, unmöglich. Um ein zuverlässiges eukaryotisches Expressionssystem mit hoher Ausbeute zu entwickeln, haben wir uns das schnell wachsende nicht-pathogene Kinetoplastida Leishmania tarentolae zu Nutze gemacht, welches sich von anderen Eukaryoten durch dessen Fähigkeit unterscheidet, Boten-RNA (messenger R/VA), die entweder durch RNA Polymerase oder sogar fremde Polymerasen generiert werden, aufgrund der natürlichen Abkoppelung der Transkription von der RNA-Prozessierung zu translatieren. Im das Erfolgreichste Prototyp das heterologe Gen wird von einem zirkulären Episom mitels T7 polymerase trascribieret. Trotz einer Ausbeute von 300 mg rekombinantem Protein pro Liter leidet dieses System an starken klonalen Variationen. Erste Resultate deuten darauf hin, dass dies mit dem Verhalten episomaler Elemente in Leishmania -Zellen zusammenhängen könnte. Die Biogenese episomaler Elemente in Ltarentolae ist kaum verstanden, und die derzeitige Anwendung zielt auf eine systematische Analyse von struktureller Dynamik, Vererbung und Transkription zirkulärer sowie linearer Episome in diesen Organismen ab. In einem komplementären Ansatz planen wir die Entwicklung eines in vitro Translationssystems mit hoher Ausbeute auf der Basis von Ltarento/ae-Exhratäen. Solch ein System ist erwartungsgemäß robuster und günstiger als andere in vitro Translationssysteme.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen