Vollautomatisiertes Laserscan-Mikroskop für Hochdurchsatz-Analysen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wurde und wird zur Identifikation neuer therapeutischer Ansätze zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt. In Anbetracht der Tatsache einer erhöhten IP3-Rezeptoraktivität im Zusammenhang mit der Pathogenese der Alzheimer’schen Krankheit, führten wir einen zellbasierten Calcium-imaging High- Throughput Screen durch. Für diesen Zweck generierten wir HEK293 Zellen, die einerseits ein Kalziumindikatorprotein (Yellow Cameleon 3.6) und andererseits eine krankheitsverursachende Presenilinmutation (PS1-M146L) exprimieren. Diese Zellen wurden in 96- oder 384-well Platten gesät. 6-8 Stunden später wurden die Compounds mit Hilfe eines Pipettierrobotors (Bravo, Agilent Technologies) als Quadrupel in verschiedene Wells pipettiert. Wir verwenden als Agonist Carbachol, welcher die Bildung von IP3 induziert und zu der Freisetzung von Kalzium aus dem enoplasmatischen Retikulum führt. Als Substanzbibliothek wählten wir DIVERSetTM 1+2 (20.000 small molecules) von ChemBridge. Diese synthetische Bibliothek ist in sehr hohem Maße wirkstoffartig und divers. Somit deckt sie ein großes Feld der Pharmakophore bei einer begrenzten Anzahl an Substanzen ab. Nach 24 Stunden färbten wir, wiederum mit Hilfe des Roboters, den Zellkern mit DRAQ5, einem roten fluorescenten DNA-Farbstoff. 1-2 Stunden später wurden die Platten im konfokalen High-Content-Screening System Opera (PerkinElmer) vermessen. Dieses ist mit einer schnellen Dosierungsvorrichtung ausgestattet, welches Carbachol in jedes Well während der Aufnahmepausen zugibt. Ein Analysenscript, das mit der Analysesoftware Acapella erstellt wurde, berechnet automatisch die Kalziumströme von einzelnen Zellen. Mit Hilfe der DRAQ5-Zellkern-Färbung detektiert das Skript die Ränder der einzelnen Zellen von der ersten Aufnahme und misst dann die Intensität der FRET Donor und Akzeptor Kanäle dieser Bilder während der Aufnahmezeit. Die FRET-Effizienz jeder einzelnen Zelle wird anschließend berechnet und normalisiert. Für jede Zelle wurden das Signalmaximum und die Zeitpunkte der Anstiegs-, Maximum- und Abfallintensität ermittelt. Schließlich wurden die Compounds als Hits gewertet, deren Signalmaximum unter 90% des Wertes der Kontrollen lag und für weitere Studien benutzt. Von 19.885 untersuchten Compounds ermittelten wir 253 Hits. Diese wurden ein zweites Mal vermessen und nicht reproduzierbare Compounds entfernt. Nach Abzug von toxischen, und/oder autofluoreszenten, falsch positiven Hits erhielten wir als endgültige Anzahl Hits des Primärscreens 78 Compounds mit denen weitere Untersuchungen gemacht wurden. Zunächst wurden diese Hits in verschiedenen Konzentrationen, verschiedenen anderen PS1-Mutationen, sowie WT und WT-PS1 (als Negativkontrollen) getestet. Es ist uns gelungen neue Wirkstoffe zu identifizieren, die eine vermehrte Speicherung bzw. Freisetzung aus intrazellulären Speichern ausgleichen. Diese Wirkstoffe werden zurzeit im Rahmen von Patentanmeldungen geschützt. In einem vorhergehenden Projekt zur Hemmung der Bildung pathologischer Prionprotein- und Synuclein-Aggregate konnte ausgehend von derselben Substanzbibliothek und mittels konfokalem fluoreszenzbasiertem Aggregatnachweis im Hochdurchsatzverfahren Wirksubstanzen identifiziert werden und weiter medizinalchemisch optimiert werden. Für eine Substanzklasse wurde hier bereits ein Patent erteilt, ein Patent für eine weitere Substanzgruppe ist eingereicht. Mit diesen Wirkstoffen konnte inzwischen auch eine Wirksamkeit in Tiermodellen gezeigt werden. Eine weitere Charakterisierung und weitere Entwicklung dieser Wirkstoffe in Synuclein-basierten Zellkulturmodellen der Parkinson Krankheit unter Nutzung des OPERA-Systems ist in Gange.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Dysregulated ER calcium release in AD: A paradigm for high throughput drug/siRNA screens. International Conference on Alzheimer's Disease (ICAD); Jul 11-16 2008, Wien, Österreich
Honarnejad K, Steiner H, Bojarski L, Kuznicki J and Herms J
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Mutant presenilin-1 mediated calcium dyshomeostasis in familial Alzheimer's disease: A target for high-throughput cellular imaging based drug discovery. 39th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Okt. 17-21, 2009 Chicago, USA
Honarnejad K and Herms J
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Restorement of dysregulated calcium homeostasis in Alzheimer's disease as target for drug discovery. Miptec Okt. 13-15 2009, Basel, Schweiz
Honarnejad K and Herms J
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Highthroughput screen for drugs targeting calciumopathy in familial Alzheimer’s disease associated with presenilin mutations. 40th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Nov. 13-17, 2010 San Diego USA
Honarnejad K, Szybinska A, Kuznicki J and Herms J
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A FRET-based High-throughput Drug Screen Targeting Dysregulated Intracellular Calcium Signaling in Alzheimer's Disease. AD/PD Mär 9-13, 2011. Barcelona, Spanien
Honarnejad K, Szybinska A, Kuznicki J and Herms J
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Identification and characterization of novel drugs for alzheimer’s disease from a FRET calcium-imaging-based high-throughput compound screen. Miptec Okt. 19-22, 2011, Basel, Schweiz
Honarnejad K, Daschner A, Szybinska A, Kuznicki J and Herms J.
