Analytische Ultrazentrifuge
Final Report Abstract
Bei der DNA-Replikation in E. coli ist das DNA-Polymerase lll Holoenzym für die Verdoppelung des Leit- und des Folgestrangs verantwortlich. Es besteht aus zehn verschiedenen Untereinheiten, die drei Subkomplexe ausbilden: Dem αεθ-Polymerasekern, der Prozessivität vermittelnden ß-Klammer und dem (τ/λ)3δδ'χψ-Komplex, der für das Laden der ß-Klammer benötigt wird („clamp loader*'). Die χ-Untereinheit des „clamp loaders" ist allerdings nicht am Laden der ß-Klammer beteiligt, ihre Funktion besteht in der Ausbildung einer Protein-Protein-Wechselwirkung mit dem Einzelstrang-DNA bindenden Protein (SSB). SSB ist für die DNA-Replikation essentiell, da es die am Folgestrang auftretende einzelsträngige DNA (ssDNA) vor Abbau schützt und das Auftreten von Sekundärstrukturen verhindert, die die Polymerase inhibieren würden. Während für SSB gezeigt wurde, dass es über seinen amphiphilen C-Terminus mit x interagiert, war die Interaktionsstelle auf χ bisher unbekannt. Daher haben wir verschiedene Aminosäuren auf der Oberfläche von χ ausgetauscht und mit Hilfe von analytischer Ultrazentrifugation (AUC) die SSB-Bindungsaffinität dieser Mutanten bestimmt. Dadurch ist es uns gelungen eine konservierte hydrophobe Bindungstasche auf der Oberfläche von χ zu identifizieren, die von basischen Resten umgeben ist. Nachdem wir zusätzlich mit Hilfe von chemischer Kreuzvernetzung und Massenspektroskopie einen Lysinrest in dieser basischen Region ermitteln konnten, der mit einem Aspartatrest im C-terminalen Bereich von SSB interagiert, konnten wir durch „molecular modelling" ein hochaufgelöstes Modell des χ/SSB- Komplexes erstellen. Pseudomonas aeruginosa verursacht einen bedeutenden Anteil der nosokomialen Infektionen und verfügt über eine Vielzahl von Resistenzmechanismen gegen Antibiotika. Bei der Untersuchung der DNA-Replikationsmaschinerie dieses Bakteriums stellte sich heraus, dass sich die ψ-Untereinheit des „clamp loader" Komplexes der DNA-Polymerase III (Paeψ) so stark in Sequenz und Größe von anderen bakteriellen ψ-Proteinen unterscheidet, dass es nicht über Sequenzvergleiche, sondern nur auf Proteinebene identifiziert werden konnte. Die Funktion des ψ-Proteins besteht in der Stabilisierung des „damp loaders" und seiner Verbindung mit der χ-Untereinheit. Durch Untersuchungen mit Hilfe von AUC und Röntgenkleinwinkelstreuung konnten wir den χψ-Komplex von P. aeruginosa charakterisieren und zeigen, dass der N-terminale Bereich von Paeψ ungefaltet ist. Weiterhin ergab sich, dass Paeψ, im Gegensatz zu E. coliψ, in der Lage ist an ssDNA zu binden, auch dann wenn diese mit SSB gesättigt ist. Dies resultiert in einem deutlichen Anstieg der Affinität von χψ gegenüber SSB/ssDNA-KompIexen und erklärt vermutlich den starken Einfluss von Paeχψ auf die Aktivität des „clamp loader" Komplexes im P. aeruginosa-SysXem. Da wir auch für P. putida ψ eine Bindung an ssDNA nachweisen konnten, scheint es sich dabei um eine Besonderheit der pseudomonalen ψ-Proteine zu handeln. Die durch den Arp2/3-Komplex nukleierte Aktinpolymerisation führt zur Ausbildung von Lamellipodien, die für die Bewegung von Zellen essentiell sind. Der intrinsisch inaktive Arp2/3-Komplex muss aber zunächst durch sogenannte „nucleation promoting factors" (NPFs) wie zum Beispiel den Scar/Wave Komplex aktiviert werden. Wir haben die 3D-Struktur von Brk1, dem Precursor des heteropentameren Scar/Wave-Konnplexes, aufgeklärt und mit Hilfe von AUC dessen Oligomerisierungszustand in einem Konzentrationsbereich von 8 nM bis 340 μM untersucht. Dies war nur durch eine Kombination von Absorptions- und Fluoreszenzoptik der AUC möglich. Dadurch konnten wir zeigen, dass Brk1 im mikromolaren Bereich zwar stabile Homotrimere ausbildet, es aber im unteren nanomolaren Bereich in Monomere zu dissoziieren beginnt. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass Brk1 auch bei Konzentrationen von ca. 1 μM Untereinheiten mit homotrimeren und heterotrimeren Brk1-Komplexen austauschen kann. Daher besteht die zelluläre Funktion von Brk1 vermutlich darin, neu synthetisierte Untereinheiten des Scar/Wave-Komplexes zu stabilisieren.
Publications
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