Functional analysis of enzymes involved in the co-translational modification of nascent chains
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bakterien initiieren die Proteinsynthese über eine spezielle Initiations-tRNA, welche mit formyliertem Methionin beladen ist. Fertig synthetisierte Proteine dagegen sind nicht formyliert und enthalten in vielen Fällen kein Methionin sondern eine abweichende N-terminale Aminosäure. Diese Variabilität der N-termini ist bedingt durch zwei aufeinanderfolgende kotranslationale Prozessierungsschritte, Deformylierung und Methioninabspaltung, die durch die Enzyme Peptiddeformylase (PDF) und Methionin-Aminopeptidase (MAP) katalysiert werden. Das Hauptziel des Projekts war ein molekulares Verständnis der zeitlichen und räumlichen Koordination der beiden Enzyme PDF und MAP sowohl mit translatierenden Ribosomen als auch mit anderen Ribosomen-gebundenen Faktoren, z.B. dem Chaperon Trigger Factor und den Targetingfaktoren SRP und SecA um eine effiziente Proteinsynthese zu gewährleisten. Im vorliegenden Projekt konnten wir mit Hilfe von Kosedimentationsexperimenten zeigen, dass sowohl PDF als auch MAP aus E. coli mittels ionischer Wechselwirkungen an Ribosomen binden. Eine Kombination aus chemischen Crosslinking-Experimenten, massenspektrometrischen Analysen, Proteinkristallographie und in silico Modellierungen führte zur Identifikation der Ribosomen-Interaktionsstellen in PDF und MAP und deren Bindestellen am Ribosom. Diese Ergebnisse ermöglichten ein erstes Modell des Komplexes bestehend aus Ribosom und beiden Enzymen, das zeigt, dass beide Enzyme nahe dem Ausgang des Polypeptidkanals auf der Oberfläche des Ribosoms lokalisiert sind und so eine effiziente Prozessierung des naszierenden Proteins gewährleisten. Es gelang uns ein gekoppeltes in vitro Transkriptions-Translationssystem zu etablieren, mit dessen Hilfe die kotranslationale Prozessierung naszierender Proteine untersucht werden konnte. Wir konnten zeigen, dass die proteolytische Prozessierung stattfindet sobald der N-Terminus des Proteins den Polypeptidkanal verlässt. Weder die Funktion von PDF noch von MAP wird durch SRP oder SecA Bindung an das translatierende Ribosom inhibiert. Dies ermöglicht gleichzeitiges und effizientes Prozessieren und Targeting naszierender Innenmembranproteine zum Translokon. Im Gegensatz dazu erfolgt die enzymatische Prozessierung vor der Faltung naszierender Proteine und der verzögerten Bindung des Chaperons Trigger Factor. Diese zeitliche Koordination der enzymatischen Prozessierung, dem Targeting und der Chaperon-assistierten Faltung wird durch zwei unterschiedliche Mechanismen gewährleistet, zum Einen durch extrem schnelle Interaktionskinetiken der Enzyme und SRP mit Ribosomen und zum Zweiten durch die verzögerte Rekrutierung des Trigger Factors, der aktive Ribosomen erst bindet nachdem etwa 80 Aminosäuren des wachsenden Proteins an der ribosomalen Oberfläche exponiert sind. Die Ergebnisse dieses Projekts führten zu einem ersten Modell der Koordination der Maturierungsfaktoren am translatierenden Ribosom. Weiterhin motivierten die Ergebnisse dieses Projekts den Start weiterer Projekte in unserem Labor, die die N-terminale Acetylierung von Proteinen in eukaryontischen Zellen untersuchen. Diese ubiquitäre Modifikation naszierender Proteine wird durch mindestens fünf verschiedene Acetyltransferasen katalysiert, deren Interaktion mit dem naszierenden Polypeptid koordiniert werden muss mit der Funktion eukaryontischer MAPs, Chaperonen und Targetingfaktoren. Die Ergebnisse dieser Studien werden zeigen, ob die Prinzipien der Koordination der Maturierungsfaktoren während der Proteinsynthese in Bakterien auch für die ungleich komplexere Situation der Proteinsynthese in einer eukaryontischen Zelle gelten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- A peptide deformylase-ribosome complex reveals mechanism of nascent chain processing. Nature 452, 108-111 (2008)
Bingel-Erlenmeyer, R. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/nature06683) - The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nature structural & molecular biology 16, 589-597 (2009)
Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N. & Bukau, B.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/nsmb.1614) - Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell 147, 1295-1308 (2011)
Oh, E. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.10.044) - Dynamic enzyme docking to the ribosome coordinates N-terminal processing with polypeptide folding. Nature structural & molecular biology 20 (2013)
Sandikci, A. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/nsmb.2615) - Co-translational mechanisms of protein maturation. Current opinion in structural biology 24, 24-33 (2014)
Gloge, F., Becker, A. H., Kramer, G. & Bukau, B.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.sbi.2013.11.004)
