Analyses of the dynamic interplay between ribosomes and bacterial translocon complexes
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Erkennung und der Transport von Proteinen, die ihre Funktion in unterschiedlichen Zellkompartimenten ausüben sollen, ist ein charakteristischer und essentieller Prozess in eu- und prokaryontischen Zellen. Allerdings sind nur wenige der bislang in unterschiedlichen Spezies identifizierten Proteintransportwege universell konserviert. Ein Beispiel ist der signal recognition particle (SRP) abhängige Transport von Proteinen zum Sec Translokon, einem membran-integralen Proteintransportkanal. SRP erkennt die Signalsequenz seiner Substrate kotranslational indem es das ribosomale Protein L23 als Hauptbindestelle nutzt. Allerdings wird eine verstärkte Ribosomenbindung von SRP bereits in einer sehr frühen Phase der Translation beobachtet, in der die Signalsequenz noch innerhalb des ribosomalen Tunnels verborgen ist. Dies deutet darauf hin, dass das Vorhandensein einer Signalsequenz innerhalb des Tunnels über bislang unbekannte Mechanismen zur verstärkten Bindung von SRP an die Ribosomenoberfläche kommuniziert wird. Unsere Daten zeigen, dass SRP und SecA, das Motorprotein des post-translationalen Proteintransportweges, mit einer flexiblen Schleife des L23 Proteins interagieren können, die innerhalb des ribosomalen Tunnels liegt. Diese Daten liefern eine mögliche Erklärung für die hochaffine Bindung von SRP an Signalsequenzen, die noch innerhalb des ribosomalen Tunnels verborgen sind. Die Daten zeigen darüber hinaus, dass die Konkurrenz zwischen SRP- und SecA-abhängigen Proteintransport bereits auf der Stufe des Ribosoms beginnen. Die Zielsteuerung und Insertion von Proteinen zum bzw. durch das Sec Translokon ist von einem komplizierten Protein-Protein Interaktionsnetzwerk abhängig und die Bestimmung dieser Interaktionen im ruhenden und aktiven Sec Translokon durch ortsgerichtete in vivo Quervernetzung war ein wesentlicher Fortschritt während der Förderperiode. In Kombination mit Massenspektrometrie konnten wir die exakten Interaktionsstellen bekannter Partnerproteine wie FtsY oder YidC kartieren, sowie bislang unbekannte Partnerproteine wie das Chaperon PpiD identifizieren. Die physiologische Bedeutung dieser Interaktionen wurde weiter analysiert und wir konnten ein neues Modell zum Transfer der naszierenden Ketten von der SRP Zielsteuerungsmaschinerie zum Sec Translokon aufstellen. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass die SecY-YidC Interaktion den Durchmesser des Sec Proteinkanals verringert, was darauf hindeutet, das YidC zumindest vorrübergehend Teil des Kanals ist. In Bakterien werden Membranproteine nicht nur durch das Sec Translokon integriert, sondern auch über YidC, das kleine Membranproteine Sec-unabhängig inserieren kann. Allerdings war bislang unklar, welche Determinanten Membranproteine entweder in den Sec- oder den YidC Weg steuern. Unsere Daten zeigen, dass auch mehrspännige Membranproteine wie MtlA oder TatC über YidC inseriert werden können. Lediglich Membranproteine mit größeren periplasmatischen Bereichen sind zwingend auf das Sec Translokon zur Insertion angewiesen, was vermutlich auf die SecA-abhängige Translokation dieser Bereiche zurückzuführen ist. SecA kann zwar mit dem Sec Translokon interagieren, vermutlich aber nicht mit YidC. Die Integration von MtlA und TatC ist zwingend auf SRP und FtsY angewiesen und unsere Daten deuten darauf hin, dass der SRP Weg Membranproteine sowohl zum Sec Translokon als auch zu YidC zielsteuern kann. Eine Interaktion von YidC mit SRP, FtsY und ribosomalen Proteinen wurde durch Quervernetzungsexperimente nachgewiesen. Elektrophysiologische Untersuchungen deuten weiterhin darauf hin, dass YidC ebenso wie das Sec Translokon einen Proteintransportkanal bildet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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