Structural and Functional Studies of the a2d voltage-gated Calcium Channel Subunit
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die extrazelluläre Region der transmembranen spannungsgesteuerten Kalzium Kanal Cavα2δ Untereinheit ist Ziel von Wirkstoffen wie Gabapentin (Neurotonin) und Pregabalin (Lyrica), die zur Behandlung von neuropathischen Schmerzen, Epilepsie, Fibromyalgie und anderen Nervensystemstörungen verabreicht werden. Trotz dieser direkten Verbindung ist nichts über die Molekularstruktur von Cavα2δ bei hoher Auflösung bekannt. Die Arbeit dieses Projektes liefert die Voraussetzungen zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von Cavα2δ. Mehrere Expressionssysteme wurden untersucht, um das am besten geeignete zu finden, mit dem große Mengen an aufgereinigtem, homogenem und funktionellem Protein gewonnen werden können, was für Kristallisation benötigt wird. Konstrukte von extrazellulärem Cavα2δ, die in einem Säugerzellsystem exprimiert wurden, dem ein spezifisches zur Prozessierung der Glykosylierung benötigtes Enzym fehlt, weisen ein homogenes Glykosylierungsmuster auf. Sekretiertes Cavα2δ Protein wurde mittels einer Einschrittaufreinigung aufgereinigt und zeigte bereits einen hohen Grad an Reinheit. Dieses Material wurde für die biochemische Charakterisierung wie Glykosylierungseigenschaften und funktionellen Studien eingesetzt. Als funktionaler Test wurde ein Ligandenbindeassay mit radioaktivem [3H]-Gabapentin aufgebaut, mit dem gezeigt werden konnte, dass die Affinitäten des rekombinanten Cavα2δ vergleichbar mit den Literaturwerten sind. Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin, dass das aufgereinigte Material vergleichbar mit dem nativen ist, und somit geeignet für Kristallisationstest ist.
