Association of mitochondrial DNA with an antioxidant system in the nucleoid structure
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mit unseren Vorbefunden hatten wir gezeigt, dass in Säugerzellen die Mangan- Superoxiddismutase (MnSOD, SOD-2) sowie die Glutathion-Peroxidase Bestandteile von „Nucleoiden“ sind, d.h. sie sind, zusammen mit anderen Proteinen, mit mitochondrialer DNA (mtDNA) assoziiert. Wir stellten die Hypothese auf, dass diese Assoziation den antioxidativen Schutz der mtDNA verstärken sollte, die sich in der mitochondrialen Matrix nahe der inneren Mitochondrienmembran befindet, d.h. in einem Kompartiment mit hoher Konzentration von reaktiven Sauerstoffspezies. Da die Assoziation der MnSOD an mtDNA nicht obligat ist, nahmen wir an, dass die Acetylierung/Deacetylierung der MnSOD ein möglicher Mechanismus für die Steuerung der Assoziation an mtDNA sein könnte. Daher mutierten wir zwei C-terminal gelegene Lysinreste zu Alanin, Glutamin bzw. Glutamat. Zur Untersuchung der Bindung dieser MnSOD-Mutanten in vitro mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) verwendeten wir ein DNA-Oligonucleotid von 34 Basenpaaren als Bindesubstrat. Wir konnten damit mühelos als Positivkontrolle die starke Bindung des mitochondrialen Transkriptionsfaktors A (TFAM) sowie von kommerziell erhältlicher prokaryontischer bzw. human MnSOD in Echtzeit verfolgen, wobei allerdings die Bindung von E.coli MnSOD zehnfach geringer war als jene von TFAM. Die Bindung von kommerzieller humaner MnSOD war wiederum zehnfach schwächer als die des E.coli-Enzyms. Alle detektierten Bindungen konnten mittels Salz gelöst werden. Aufgrund der niedrigen Bindungsstärke unserer gereinigten wildtypischen bzw. mutierten MnSOD-Versionen, die sich auch im Fehlen jeglicher Sättigung der Bindung innerhalb der Beladungsphase manifestierte, war es uns leider nicht möglich, Bindungskinetiken aufzunehmen. Wir schließen aus den obigen Ergebnissen, dass mit dem Material, so wie wir es in E.coli exprimieren und reinigen konnten, die Bindung von MnSOD und DNA überraschend schwach ist. Möglicherweise war unsere Methode der Proteinüberexpression und -Reinigung nicht optimal und führte zu einem Funktionsverlust, was durch den Befund einer niedrigen spezifischen Enzymaktivität unterstützt wird. Des Weiteren haben wir ein modifiziertes Protokoll unseres zuvor aufgebauten automatisierten „Fluorimetric Detection of Alkaline DNA Unwinding‟ (FADU) Assays zu Detektion von oxidativen DNA-Basenschädigungen weiterentwickeln können. Wir konnten anhand der Behandlung von Plasmid-DNA mit dem Peroxynitrit-Donor Sin-1 oxidative Basenschädigung nachweisen und ebenso die dosisabhängige protektive Wirkung von MnSOD bei dieser Reaktion. Mit diesem experimentellen System gelang es uns, im Rahmen einer Kooperation die Peroxynitrit-inaktivierende Wirkung der neuroprotektiven Substanz Minocyclin zu belegen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2008) MnSOD and ALDH-2 deficiency increase mitochondrial oxidative stress and aggravate age-dependent vascular dysfunction. Cardiovasc Res, 80:280-9
Wenzel P, Schuhmacher S, Kienhöfer J, Müller J, Hortmann M, Oelze M, Schulz E, Treiber N, Kawamoto T, Scharffetter-Kochanek K, Münzel T, Bürkle A, Bachschmid MM, and Daiber A
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(2009) Association of mitochondrial antioxidant enzymes with mitochondrial DNA as integral nucleoid constituents. FASEB J 23:2034-44
Kienhöfer J, Häussler DJ, Ruckelshausen F, Weber K, Pimentel D, Ullrich V, Bürkle A, Bachschmid MM
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Association of mitochondrial antioxidant enzymes with mitochondrial DNA as integral nucleoid constituents. PhD Dissertation, University of Konstanz, 2009
Kienhöfer J
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(2010) Selective scavenging of peroxynitrite by the neuroprotective drug minocycline. J Biol Chem 286:4991-5002
Schildknecht S, Pape R, Müller N, Robotta M, Marquardt A, Bürkle A, Drescher M, Leist M
