Konfokales Laserraster-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das konfokale Laserrastermikroskop (confocal laser scanning microscope, CLSM) wurde für die Abbildung von verschiedenen Membransystemen sowie Zellsystemen eingesetzt. Im speziellen konnten wir eine ganze Reihe von Forschungsprojekten durch Einsatz des CLSM vorantreiben: 1) Mittels Riesenvesikeln, die über Avidin-Biotin an eine Siliziumoberfläche gekoppelt werden, konnten die Translokationseigenschaften des aus HIV-1 stammenden Proteins Tat über Lipidmembranen zeitaufgelöst verfolgt werden. 2) Ebenfalls basierend auf immobilisierten Riesenvesikeln konnten wir die Integration von GFP- und fluoreszenzmarkierten Connexonen (Cx26 und Cx43) mit Hilfe des CLSM untersuchen. Bei diesen Untersuchungen stand der Transfer von Farbstoffen zwischen durch Connexone gekoppelte Riesenvesikel im Vordergrund. 3) Mit Hilfe des CLSM haben wir uns mit der Frage der Phasenseparation von porenüberspannenden Membranen sowie dem Bindungsverhalten von bakteriellen Toxinen beschäftigt. 4) Es wurde ein Fusionsassays auf Basis porenüberspannender Membranen entwickelt. Mit Hilfe dieses Assays kann die Fusion von unilamellaren Vesikeln mit porenüberspannenden Membranen mit Hilfe des Förster-Resonanz-Energietransfers als Funktion von Fusogenen zeitaufgelöst beobachtet und der Prozess quantifiziert werden. Dies erlaubt eine detaillierte Analyse von Proteinmediierten Fusionsprozessen. 5) Fluoreszenzfarbstoffe, eingeschlossen in die Kavitäten von porösen Siliziumsubstraten, welche mit einer Membran überspannt sind, können mit Hilfe von z-stacks im Konfokalmikroskop visualisiert werden. Dies dient als Grundlage für weitere Entwicklungen im Bereich des Aufbaus des Fusionsassays. Zudem erlaubt es der Einschluss von fluoreszenzsensitiven Farbstoffen den Aufoder Abbau von pH-Gradienten zeitaufgelöst zu verfolgen, und so die Aktivität von protonentransportierenden Molekülen und Proteinen zu analysieren. 6) Wir konnten in den letzten zwei Jahren Funktionalisierungsstrategien entwickeln, die es erlauben, Membranen unter Erhalt der optischen Transparenz von porösen Aluminatsubstraten aufzubauen. Dadurch ist es möglich geworden, zum einen die Herstellung von Lipidmembranen auf den porösen Aluminaten zu verfolgen und zum anderen den Einschluss von Farbstoffen in die unter den Membranen befindlichen Kavitäten zu visualisieren. 7) Wir beschäftigen uns außerdem mit der Bindung des Zytoskeletts an Lipidmembranen. Wir sind der Frage nachgegangen, welche Faktoren für die Aktivierung von Ezrin verantwortlich sind. Zu diesem Zweck wird die Bindungsfähigkeit des Proteins Ezrin an F-Aktin genutzt. Mit Hilfe des CLSM konnte die Bindung von fluoreszenzmarkiertem F-Aktin an verschiedene Ezrin-Mutanten analysiert und quantifiziert werden. 8) Das CLSM wurde eingesetzt, um die Funktionalisierung von kolloidalen Sonden zu überprüfen. Dabei standen Membran-ummantelte Glaskugeln eines AFM-Cantilevers im Mittelpunkt der Untersuchungen und es konnte die Diffusion von Lipiden auf diesen Sonden gemessen werden. 9) Ferner wurde das CLSM eingesetzt, um die Auswirkungen von Wachstumsfaktoren, wie TGF-β, auf die Veränderungen des Zytoskeletts verschiedener Zelllinien zu untersuchen. Dabei wurden dreidimensionale Aufnahmen erstellt, welche Veränderungen des Zell-Zell Kontaktes und der Zellmorphologie dokumentieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Viscoelasticity of pore-spanning polymer membranes derived from giant polymersoms. Soft Matter 2010, 6, 2508-2516
Kocun, M., Mueller, W., Maskos, M., Mey, I., Geil, B., Steinem, C., Janshoff, A.
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A membrane fusion assay based on pore-spanning membranes. Soft Matter 2011, 7, 1644-1647
Höfer, I., Steinem, C.
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Activation of F-actin binding capacity of ezrin: synergism of PIP2 interaction and phosphorylation. Biophys. J. 2011, 100, 1708-1717
Bosk, S., Braunger, J., Gerke, V., Steinem, C.
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Dynamics of TGF-β induced epithelial-to-mesenchymal transition monitored by electric cell-substrate impedance sensing. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. 2011, 1813, 2099-2107
Schneider, D., Tarantola, M., Janshoff, A.
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Mechanistic insights into the translocation of full length HIV-1 Tat across lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes 2011, 1808, 2685-2693
Boll, A., Jatho, A., Czudnochowski, N., Geyer, M., Steinem, C.
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Orthogonal functionalization of nanoporous substrates: control of 3D surface functionality. ACS Appl. Mater. Interfaces 2011, 3, 1068-1076
Lazzara, T. D., Kliesch, T.-T., Janshoff, A., Steinem, C.
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Preparation of solvent-free, pore-spanning lipid bilayers: modeling the low tension of plasma membranes. Langmuir 2011, 27, 7672-7680
Kocun, M., Lazzara, T. D., Steinem, C., Janshoff, A.
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Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS Nano 2011, 5, 6935–6944
Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C.
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(2012) A model system for cell adhesion mediated by weak carbohydrate-carbohydrate interactions. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 3326-3329
Lorenz, B., Álvarez de Cienfuegos, L., Oelkers, M., Kriemen, E., Brand, C., Stephan, M., Sunnick, E., Yueksel, D., Kalsani, V., Kumar, K., Werz, D., Janshoff, A.
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Creating and modulating microdomains in pore-spanning membranes. ChemPhysChem 2012, 13, 108-114
Orth, A., Johannes, L., Römer, W., Steinem, C.
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Green fluorescent protein changes the conductance of connexin 43 (Cx43) hemichannels reconstituted in planar lipid bilayers. J. Biol. Chem. 2012, 287, 2877-2886
Carnarius, C., Kreir, M., Krick, M., Methfessel, C., Moehrle, V., Valerius, O., Brüggemann, A., Steinem, C., Fertig, N.
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Phospholipids as an alternative to direct covalent coupling: Functionalization of nanoporous alumina for protein recognition and purification. J. Coll. Inter. Sci. 2012, 366, 57-63
Lazzara, T. D., Behn, D., Kliesch, T.-T., Janshoff, A., Steinem, C.
