Molekulare Regulation der duktalen Zelllinie im Pankreas und im Pankreaskarzinom
Final Report Abstract
Für die Entwicklung des Pankreas ist ein präzise koordiniertes Zusammenspiel von Genexpression regulierenden Transkriptionsfaktoren notwendig, damit am Ende der Entwicklung aus gering differenzierten Vorläuferzellen die ausdifferenzierten, funktionalen Zellen werden. Die drei Hauptzelltypen des Pankreas sind endokrine Inselzellen, enzymbildende azinäre Zellen und duktale Zellen, die die Gänge zur Weiterleitung des Enzymsekrets bilden. Einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren für die Pankreasentwicklung ist das Protein pancreatic and duodenal homeobox-1, PDX-1. In Vorabeiten wurde bereits herausgefunden, dass PDX-1 die Expression des duktalen Markergens Keratin-19 (Krt19) negativ beeinflusst. In dem beantragten Projekt sollte genauer untersucht werden, welche funktionellen Einheiten von PDX-1 für diese Regulation notwendig sind. Anders als zunächst geplant, gelang es nicht, primäre pankreatische duktale Zellen (PDCs) stabil mit PDX-1 bzw. mutierten Varianten zu transfizieren, so dass Zelllinien entstehen, die dauerhaft PDX-1 bzw. mutierte Varienten exprimieren. Dennoch konnten PDX-1 und die Varianten vorübergehend in PDCs epxrimiert werden. So konnte gezeigt werden dass der NH2-terminale Anteil von PDX-1 für die negative Regulation von Krt19 verantwortlich ist. Darüber hinaus wurde in DNA-Bindungsversuchen demonstriert, dass PDX-1 mit seinem NH2-terminalen Anteil an die Promoter-DNA von Krt19 bindet, da Deletion des NH2-Terminus zu einem Bindungsverlust führt. In einem weiteren Schritt sollte untersucht werden, ob der Transkriptionsfaktor MEIS1 mit PDX-1 interagieren kann und möglicherweise mit PDX-1 in der Repression von Krt19 kooperiert. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass PDX-1 in der Lage ist, MEIS1, welches an den Krt19 Promoter bindet, ebenfalls negativ zu regulieren, und dass das Entfernen von MEIS1 aus PDCs eine ebenfalls negative Wirkung auf die Transkription von Krt19 hat. Besonders interessant ist hierbei, dass PDX-1 MEIS1 nicht auf transkriptioneller Ebene reguliert, sondern posttranskriptionell über Proteasom-vermittelte Degradation. Daher kann man aus den Daten schließen, dass PDX-1 über zwei verschiedene, nicht-redundante Mechanismen verfügt, die Krt19 Expression negativ zu regulieren: Durch direkte DNA Bindung an den Krt19 Promoter und durch gesteigerte Degradation des Transkriptionsfaktors MEIS1, welcher für die Transkription von Krt19 in PDCs erforderlich ist. Um weitere Faktoren zu identifizieren, wurde eine Antikörper vermittelte Fällung von PDX-1 vorgenommen und assoziierte Proteine durch Massenspektrometrie identifiziert. Mit dieser Technik konnten u.a. PDX-1 Interaktionspartner identifiziert werden, die sich an der Regulation der Chormatinstruktur beteiligen und damit zur Aktivierung oder Repression von Genen beitragen können. In einem zweiten Teil sollte Untersucht werden, welche Rolle Krt19 (auch: K19) positive duktale Zellen in vivo im Rahmen von Regeneration und Tumorigenese des Pankreas spielen. Hierbei sollten duktale Zellen genetisch mit Hilfe des Enzyms Cre oder der induzierbaren Form CreERT2, die unter Kontrolle des Krt19 Promoters exprimiert werden, markiert werden. Bei der Verwendung von den in dem Gastlabor generierten K19Cre- oder K19CreERT2-Mäusen mussten jedoch erhebliche Einschränkungen hingenommen werden: So führte die Verwendung der K19Cre-Maus nicht nur zur Markierung duktaler Zellen, sondern auch azinärer Zellen, so dass dieses Modell zur Untersuchung von Regenration im Pankreas unbrauchbar ist. Wurde diese Maus mit einer Maus verpaart, die tumorinduzierendes Kras nach Cre-vermittelter Rekombination exprimiert, so gab es keine Nachkommen, die aktiviertes Kras hatten, vermutlich aufgrund embryonaler Letalität der K19Cre-vermittelten aktivierung, die auch in anderen, K19-exprimierenden Geweben stattfindet. Auch die Verwendung der K19CreERT2 Maus konnte nicht zur Markierung duktaler Zellen verwendet werden, da das Expressionsniveau im Pankreas äußerst gering war. In anderen Organen, wie z. B. Magen und Duodenum,war die Expression jedoch suffizient. So konnte in Studien, die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Timothy c. Wang an der Columbia University, New York City, NY, durchgführt wurden, gezeigt werden, dass K19 möglicherweise Stammzellen im Magen-Darmtrakt markiert. Expression von aktiviertem Kras nach K19CreERT2 vermittelter Rekombination führte zwar nicht zu Tumoren im Pankreas aufgrund der eingeschränkten Rekombinationsrate, jedoch zu Dysplasien im Magen und Tumoren in der Lunge. Auch wenn das gewählte Modell somit nicht zur Untersuchung des Pankreas tauglich ist, so ist es doch ein weiteres Werkzeug zur Untersuchung der Karzinogenese in der Lunge und möglicherweise zur weiteren Charakterisierung von intestinalen Stammzellen.
Publications
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The Meis Tale Transcription Factor Regulates K19 Gene Transcription in Pancreatic Ductal Epithelial Cells. Gastroenterology, Volume 134, Issue 4, Supplement 1, 2008
Johannes von Burstin, Melanie P. Wescott, Therese B. Deramaudt, Anil K. Rustgi
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A Novel Mouse Model, K19CreERT2; Rosa26R, for the Selective and Specific Marking of Pancreatic Ductal Epithelial Cells. Gastroenterology, Volume 136, Issue 5, Supplement 1, 2009
Johannes von Burstin, Sherri-Gae Scott, Maximilian Reichert, Melanie P. Wescott, Steven D. Leach, Anil K. Rustgi
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The Homeobox Transcription Factor PDX-1 Negatively Regulates the Hox-Cofactor Meis Posttranscriptionally. Gastroenterology, Volume 136, Issue 5, Supplement 1, 2009
Johannes von Burstin, Melanie P. Wescott, Maximilian Reichert, Anil K. Rustgi
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(2010) The Pancreatic and Duodenal Homeobox Protein PDX-1 Regulates the Ductal Specific Keratin 19 through the Degradation of MEIS1 and DNA Binding. PLoS ONE 5(8): e12311
von Burstin J, Reichert M, Wescott MP, Rustgi AK
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Lineage Tracing of Cytokeratin 19 Selectively Marks Gastric Pit Progenitor Cells. Gastroenterology, Volume 138, Issue 5, Supplement 1, 2010
Samuel Asfaha, Michael Quante, Johannes von Burstin, Anil K. Rustgi, Timothy C. Wang
