Untersuchungen zur Rolle der SNARE Proteine bei der Funktion von zytotoxischen T-Lymphozyten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir haben in diesem Antrag die Rolle diverser SNARE- und SNARE-assoziierter Proteine in zyotoxischen T-Lymphozyten (CTL) des Immunsystems untersucht. CTLs sind für den menschlichen Körper von großer Bedeutung, da sie über Antigen-präsentierende Zellen (APC) körperfremde Substanzen erkennen und selektiv abtöten. Die Lyse der APC erfolgt an einem dynamischen Zell-Zell-Kontakt zwischen CTL und APC, der immunologischen Synapse (IS), durch die Freisetzung von Perforin und Granzymen aus lytischen Granula (LG). Transport, Maturierung durch verschiedene intrazelluläre Organellen und Fusion der LGs mit der Plasmamembran werden vermutlich durch SNARE-Proteine vermittelt und durch SNARE-assoziierte Proteine moduliert. Wir haben zunächst die Expression von 28 SNARE-Proteinen und 4 Mund 3-lsoformen in humanen CTLs mittels RT-PCR getestet Daraufhin konnten wir 4 SNARE-Proteine und 3 Mund 3-lsoformen ausschließen, da ihre RNA nicht nachweisbar war. Die anschließende Lokalisationsanalyse mit Hilfe spezifischer Antikörper lieferte sieben Kandidaten aus der SNARE-Familie, die nach Etablierung des Zell-Zell-Kontakts zwischen CTL und APC eine präferentielle Lokalisation an der IS zeigten. Daraufhin haben wir die Funktion von zwei dieser Kandidaten, syntaxin7 und vti1b, näher untersucht. Mit Hilfe einer dominant-negativen Mutante sowie mit siRNA konnten wir zeigen, dass syntaxin7 Blockade zu einer dramatischen Reduktion der Tötungseffizienz von CTLs führt. Durch Echtzeitvisualisierung einzelner LGs an der IS mittels TIRF-Mikroskopie wurde deutlich, dass LGs nicht nur keinerlei Fusion mit der Plasmamembran zeigten, sondern dass ihre Anzahl an der IS signifikant reduziert war. In weiterführenden Experimenten konnten wir dann zeigen, dass syntaxin7 eine essentielle Rolle bei dem Transport von T-Zell Rezeptoren durch Endosomen, speziell bei der Fusion von frühem mit spätem Endosom, spielt Für vti1b konnten wir einen völlig neuen Transportweg in humanen CTLs identifizieren. Intrazelluläre Kompartimente, die endozytierte CD3-Rezeptoren enthielten, bilden ein Vesikelpaar mit LG, und diese Paare werden mit höherer Effizienz zur IS transportiert und dort immobilisiert. Abwesenheit von vti1b führt zu einer signifikanten Reduktion der Paarbildung und als Folge davon verringerten LG Fusion. In weiteren Studien haben wir in murinen CTLs die Primingfunktion von Mund 3-4 zeigen können. Überraschenderweise ist Mund3-1 RNA in murinen CTLs nachweisbar, und Mund 3-1 Protein kann den schweren Sekretionsphänotyp von murinen Mund 3-4 KO CTLs auf einen Wert weit über Wildtypniveau heben. Dieser Effekt ist nicht konzentrationsabhängig, da Erhöhung der Mund 3-1-Konzentration durch Gabe von Phorbolester zu einer Reduktion der Sekretion führt. Zusammenfassend wurde durch die Bearbeitung des Projektes ein deutlich besseres molekulares Verständnis der zytotoxischen Funktion primärer menschlicher und muriner Lymphozyten erreicht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2011). Syntaxin7 is required for lytic granule release from cytotoxic T lymphocytes, Traffic 12 , 890-901
Pattu V, Qu B, Marshall M, Becherer U, Junker C, Matti U, Schwarz EC, Krause E, Hoth M, Rettig J
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(2012). Docking of lytic granules at the immunological synapse requires Vti1b-dependent pairing with TCR-containing endosomes. J. Immunol. 186, 6894-6904
Qu B, Pattu V, Junker C, Schwarz EG, Bhat SS, Kummerow C, Marshall M, Matti U, Neumann F, Pfreundschuh M, Becherer U, Rieger H, Rettig J, Hoth M
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(2012). SNARE protein expression and localization in human cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 42, 470-475
Pattu V, Qu B, Schwarz EC, Strauß B, Weins L, Shruthi S, Bhat SS, Halimani M, Marshall M, Rettig J, Hoth M
