Lipid-Protein-Wechselwirkungen bei der Aktivierung von G Protein-gekoppelten Rezeptoren am Beispiel von Rhodopsin
Final Report Abstract
Mit Hilfe von Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Differenzenspektroskopie können die strukturellen und funktionellen Veränderungen von Protein und insbesondere auch von Membranproteinen in Ihrer nativen Umgebung untersucht werden. Wir untersuchten die Aktivierungsmechanismen des G Protein-gekoppelten Photorezeptors Rhodopsin unter eine Reihe von Zielsetzung mit teilweise neu entwickelten spektroskoptschen Methoden. Eine dieser Methoden beinhaltet die Spektroskopie von Azido-Labels, die mit Hilfe von nicht-natürlicher Aminosäuren-Mutegenese in eukaryotischen HEK Zelllinien ortsgerichtet in Rhdoopsin eingebaut werden. Diese Labels erlauben es, Veränderungen der elektrostetischen Umgebung in interhelikalen Netzwerken durch die mit der Aktivierung verbundenen Helixbewegungen innerhalb des Rezeptors zu detektieren und damit die Helixbewegungen selbst zu charakterisieren. In einem weiteren Ansatz versuchen wir Konformationsänderungen des Rezeptors in einem für Ligandenbindung zugänglichen Rezeptor-Monolayer zu verfolgen. Dies ist möglich mit Hilfe von Oberflächen-verstärkter Infrarot Absorptions (SEIRA) Spktroskopie mit Rezeptoren, die an eine SEIRA- aktive, nanostrukforierte Gold-Oberfläche gebunden sind. Durch Inkorporation des Rezeptors tn sogenannte Nanodisks, dem HDL ähnliche Lipoproteine, wird der Rezeptor in eine stabilisierende Lipid-Umgebung gebracht die als Lipoprotein-Partikel trotzdem löslich ist und an die SEIRA Oberfläche gebunden werden kann. Der Rezeptor behält seine Funktionalität und die Aktivierung kann trotz der intrinsisch sehr kleinen Signalintensität des Monolayers mit SEIRA Differenzen-Spektroskopie verfolgt werden. Zuletzt untersuchten wir die Möglichkeit die Abfolge von Reaktionsintermediaten über Veränderungen der Lipid-Umgebung spezifisch zu verändem. Mit dieser Methode konnten wir ein bereite bestehendes Modell der Aktivierung Rhodopsins erweitem und die thermodynamischen Eigenschaften der Intermediate in einer nativen Lipid-Membran bestimmen. Dies erlaubte uns weiterhin eine spezifische Stabilisierung eines sonst fast ausschließlich transient gebildeten Intermediates, Mete Ila, und dessen strukturelle und funktionelle Charakterisierung mit FTIR Spektroskopie. Aufgrund dieser Ergebnisse sind wir nun in der Lage, die bei der Rezeptor-Aktivierung ablaufenden Veränderungen deteilliert zu beschreiben und den einzelnen Intermediaten zuzuordnen.
Publications
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