Hochdurchsatz Genom Sequenzierer
Final Report Abstract
Im Rahmen von DFG-, EU und BMBF-geförderten Projekten wurde das Gerät während der letzten 3 Jahre genutzt, um DNA-Methylierungsmuster in lokalen Genombereichen mittels Hochdurchsatz-Bisulfit-Sequenzierung zu ermitteln. Durch die Besonderheit der GS-FLX-Technologie, lange Sequenzlängen zu erzeugen, können die Muster größerer chromosomaler Abschnitte betrachtet werden. So wurden potentielle Methylierungsmarker in Darmkrebs-Zellinien sowie xenotransplantierten Tumoren sequenziert und charakterisiert. Zur Zeit werden für die Darmkrebsentstehung und –entwicklung wichtige Epidermale Waschtumsfaktor-Liganden in mikrodissektierten Tumorschnitten detailliert evaluiert. Parallel dazu wurden in einem weiteren BMBF-geförderten Projekt frühe intestinale Adenome im Mausmodell betrachtet. So konnten mit Hilfe der GS-FLX-Technologie nicht nur Daten aus MeDIP-Seq-Experimenten, die eine epigenetische Veränderungen während der Adenomentwicklung aufzeigten, bestätigt werden, sondern auch der Verlauf dieser Veränderungen anhand der erhaltenen Muster genauer beschrieben werden. Die Weiterentwicklung der vorhandenen Amplikonsequenzierungstechnik in unserem AK ermöglichte es, DNA-Methylierung simultan auf beiden DNA-Strängen des selben Chromosoms zu kartieren. Ein Augenmerk liegt in diesem Zusammenhang auf der Strang-spezifischen Methylierung repetitiver Elemente in frühen Mausembryonen. In einem neu gestarteten, von der EU finanzierten Projekt soll der Langzeit-Einfluß pharmazeutischer Wirkstoffe auf die epigenetischen Muster primärer Hepatozyten und verwandter Zellinien untersucht werden. Nach Abschluss der genomweiten Grobkartierung werden prominente Regionen ausgesucht und die epigenetischen Muster detailliert mittels GS-FLX-Technologie bestimmt und charakterisiert werden. Die Schwierigkeit, bisulphit-konvertierte DNA-Abschnitte zu sequenzieren, liegt in der niedrigen Komplexität der DNA-Sequenz und dabei insbesondere im vermehrten Vorhandensein von Homopolymerfolgen. Diese verursachen nicht nur vermehrt Sequenzierfehler, sondern auch Probleme beim späteren Abgleich mit Referenzsequenzen. Aus diesem Grund musste eine Auswertepipeline beginnend mit den prozessierten Rohdaten entwickelt werden, welche die Optimierung der Sequenzabgleiche, die Bestimmung der Methylierungsrate pro individuellem Sequenzabschnitt und CpG-Position zur Aufgabe hatte. Des weiteren wurden QC-Standards wie auch statistische Methoden in das Auswerteprogramm mit aufgenommen.
Publications
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