Aufnahmemechanismen von elektrostatisch stabilisierten Nanpartikeln (MEON) in an atheroklerotischer Plaquebildung beteiligten Zelltypen
Orthopaedics, Traumatology, Reconstructive Surgery
Final Report Abstract
Übergreifendes Ziel des Projektes war es, für VSOP die Mechanismen zu untersuchen, die zu deren Anheftung an und zur Aufnahme in Zellen führen, die an der Atherosklerose beteiligt sind. Die Aufnahme von VSOP sowohl in monozytären THP-1-Zellen als auch in THP-abgeleiteten Makrophagen (THP-MΦ) ist effizienter war als für Resovist®, ohne dabei Zytotoxizität zu induzieren oder normale Zellfunktionen zu verändern. VSOP wurden mit hoher Affinität zur Zelloberfläche und zu apoptotischen Membranvesikeln gebunden. Da die Synthese großer Mengen membrangebundener und extrazellulärer Proteoglykane ein Merkmal der THP-1-Zellen ist, haben wir angenommen, dass VSOP eine hohe Affinität zu diesen komplexen Makromolekülen hat und dass diese glykosylierten Moleküle als Mediatoren für eine schnelle intrazelluläre Aufnahme dienen. Die Hemmung der GAG-Synthese durch Glukose-Entzug in THP-MΦ ging mit einer signifikanten Reduktion der VSOP-Bindung einher, während die Resovist®-Aufnahme unverändert blieb. Das Chondroitinsulfat-Proteoglykan Versican in seinen Isoformen V0 und V1 wird in THP-1-Zellen vorherrschend exprimiert. Tatsächlich war ein großer Teil der zelloberflächengebundenen VSOP durch Chondroitinase ABC-Behandlung entfernbar. Dieses Enzym spaltet vorzugsweise die Chondroitinsulfate A, B und C und in geringerem Maße Chondroitin und Hyaluronsäure, was darauf hindeutet, dass diese Strukturen an der Bindung und Aggregation von VSOP auf der Zelloberfläche von THP-1-Zellen beteiligt sind. Unsere in vitro Beobachtungen deuten darauf hin, dass die starke Interaktion von VSOP mit den Membranen von Zellen und apoptotischen Vesikeln über die Bindung an negativ geladene GAGs erfolgt. Diese Ergebnisse unterstützten in vivo Daten von atherosklerotischen Kaninchen (TP-03), welche zeigten, dass sich VSOP an GAG-reichen Membranvesikeln anreichern. Experimente an atherosklerotischen LDLR-/- Mäusen deckten den bisher unbekannten Aufnahmemechanismus von VSOP in atherosklerotische Läsionen auf. LDLR-/- Mäuse mit fortgeschrittener Atherosklerose wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Injektion von VSOP mittels MRT und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert. Post mortem MRI stellte die VSOP-Markierung von atherosklerotischen Plaques beginnend 10 Minuten nach der Injektion dar, mit zunehmenden Signaländerungen über die ersten 3 Stunden. TEM zeigte, dass die intensive Plaque-Markierung durch beschleunigte Transzytose von VSOP durch Plaque-Endothelzellen (EC) vermittelt wird. Experimente mit Endozytoseinhibitoren und siRNA zeigten einen Dynamin-abhängigen Mechanismus, der sowohl Clathrinals auch Caveolin-vermittelte Prozesse umfasst. In vitro-Experimente mit Endothelzellen zeigten, dass proatherogene Strömungsbedingungen in Kombination mit pro-inflammatorischer Stimulation, die beide in Plaquebereichen vorliegen, für die beschleunigte Endozytose von VSOP bei atherosklerotischen Läsionen verantwortlich sind. Unsere Studie zeigte, dass VSOP eine nicht-invasive MRT-Darstellung der beschleunigten endothelialen Transzytose ermöglicht (26). Darüber hinaus untersuchten wir das langfristige Schicksal und die metabolische Verarbeitung von VSOP bei atherosklerotischen LDLR-/- Mäusen. Mit Hilfe der Magnetpartikelspektroskopie (MPS, TP-09) in Kombination mit histologischer Analyse und TEM fanden wir heraus, dass VSOP von Endothelzellen und Makrophagen von Leber und Milz gereinigt werden. Die Experimente zeigten einen Abbau des superparamagnetischen Eisenoxids von VSOP in Lysosomen und eine Umwandlung in nicht-magnetisches Eisen, überwiegend gebunden in Ferritin-Komplexen, in Leber und Milz, sowie in atherosklerotischen Läsionen. Wir vermuten, dass die VSOP-GAG-Interaktion in einer Transchelierungsreaktion stattfindet, bei der die Citratschicht des kationischen Eisenoxidkerns der VSOPs durch eine GAG-Schicht ersetzt wird, da GAGs aufgrund der großen Anzahl von Carboxyl- und Sulfatgruppen eine hohe Chelatisierfähigkeit aufweisen. Diese Hypothese wurde durch die Beobachtung gestützt, dass sich die magnetischen Eigenschaften von VSOPs unmittelbar nach Kontakt mit Zellen ändern. Mit Hilfe von MPS (TP-09) in Kombination mit der TEM konnten wir magnetische Veränderungen von VSOP als Reaktion auf zellulären Kontakt und Aufnahme erkennen, die möglicherweise zu einer Signalverbesserung in der MRT und im MPI führen könnten. In VSOP- Proben ohne Zellkontakt ermöglichte MPS eine hochgenaue Quantifizierung. Im Gegensatz dazu überschätzte MPS die Menge der zellassoziierten und internalisierten VSOP. Analysen der MPS-Spektralform zeigten deutliche Veränderungen im magnetischen Verhalten von VSOP als direkte Reaktion auf die Zellaufnahme. Diese Änderungen waren proportional zur Abweichung zwischen MPS und der tatsächlichen Eisenmenge und ermöglichten somit eine angepasste Eisenquantifizierung. Die TEM lieferte den visuellen Nachweis, dass Veränderungen der magnetischen Eigenschaften mit der Zelloberflächeninteraktion von VSOP sowie mit Veränderungen der Partikelstruktur und -anordnung während des phagozytischen Prozesses korrelieren.
