Biochemie von Oxygenasen: Mechanistische Untersuchungen an einer Cofaktor-unabhängigen, Kohlenmonoxid freisetzenden Dioxygenase mit a/ß-Hydrolase-Faltung

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Susanne Fetzner; Dr. Reinhard Kappl
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2008 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 91767900

Die 2-Methyl-3-hydroxy-4(1H)chinolon-2,4-dioxygenase (Hod) katalysiert die Spaltung ihres organischen Substrats zu Kohlenmonoxid und N-Acetylanthranilat. Hod ist eine Cofaktorunabhängige Dioxygenase mit α/β-Hydrolase-Faltung. Im Rahmen dieses Projektes soll der Reaktionsmechanismus dieser Cofaktor-freien Oxygenase charakterisiert und mit den Mechanismen Flavin- und Metallion-abhängiger Oxygenasen verglichen werden. Mit Hilfe der pre-steady-state-Kinetik wird der zeitabhängige mikroskopische Verlauf der Reaktion analysiert; unter Einbeziehung vorhandener Strukturdaten (von Dr. R. Steiner, London) sollte es möglich werden, die enzymatische Reaktion auf molekularer Ebene zu verstehen. Die Untersuchungen umfassen: (1) Bestimmung der Dissoziationskonstanten von Hod bzw. Hod-„Muteinen“ mit organischen Substraten; (2) Stopped-flow-Spektrophotometrie/ Spektrofluorometrie zum Nachweis von Intermediaten und zur Bestimmung der „mikroskopischen Geschwindigkeitskonstanten“; (3) Kinetische Charakterisierung der von Hod- „Muteinen“ katalysierten Reaktion zur Aufklärung der funktionellen Bedeutung einzelner Reste des aktiven Zentrums; (4) Untersuchung von pH-Effekten auf die Reaktionskinetik zur Identifizierung von pKa-Werten ionisierbarer Gruppen (Substrat/Enzym) und zum Nachweis der Beteiligung katalytischer Reste an Protonentransfer-Schritten; (5) Nachweis und Charakterisierung transienter Radikale durch rapid-freeze ESR-Spektroskopie, ggf. unter Einbeziehung isotopensubstituierter Substrate.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen