Konfokales Laserscanning-Mikroskop für Multifluoreszenz-Detektion
Final Report Abstract
Das konfokale Laserscanning-Mikroskop LSM710 wurde für verschiedene Projekte des Nephrologischen Forschungslabors und von Kollaborationspartnern erfolgreich eingesetzt. Die wichtigsten Projekte sind im Folgenden skizziert: Projekt: Einfluss des PDZ-Domänen Proteins PICK1 auf Proteine der NEPH-Familie. In diesem Projekt wurde das LSM710 für die Mikroskopie von Drosophila Augenimaginalscheiben und von adulten Fliegenaugen eingesetzt. Bei der Imaginalscheibenmikroskopie wurden die Entwicklungsdefekte und die Verteilung von NEPH/Nephrin Proteinen in Abhängigkeit von PICK1 untersucht. Die Entwicklungsdefekte wurden auch an adulten Augen studiert. Die Technik der Mikroskopie der Autofluoreszenz von adulten Augen mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop ist unseres Wissens von uns zum ersten Mal beschrieben worden. Projekt: NFκB Signalling im Podozyten. Podozyten sind die epithelialen Zellen des Nierenfilters und entscheidend für dessen Funktion. Entzündungsvorgänge sind eine der Hauptursache für fortschreitende Nierenerkrankungen und in diesem Projekt wird aktuell der NFκB Signalling Pathway im Podozyten untersucht. Hierfür werden zum einen Nierenschnitte mikroskopiert, zum anderen Migrationassays an Zellkulturen durchgeführt. Projekt: Feinstruktur von Podozyten. Wir haben ein transgenes Mausmodell entwickelt, um die Zellmorphologie von glomerulären Podozyten, einem Zelltyp im Glomerulus der Niere, mittels Fluoreszenzmikroskopie so detailliert darzustellen, wie dies bis Dato nur mittels Elekronenmikroskopie möglich war. Wir nutzen hierfür die induzierbare, und somit modulierbare, Expression von membrangebundenem GFP in den Podozyten. Wir konnten dank der exzellenten Optik des LSM710 die Feinstrukturen (sog. Fußfortsätze) sowohl an fixierten Proben (inkl. 3D Rekonstruktion) darstellen, als auch an lebenden Podozyten im Glomerulus deren Dynamik zu erfassen. Projekt: Calcium Signalling im Podozyten. In diesem Projekt wird der Einfluss von Calcium Signalling auf Podozyten sowohl im Zellkulturmodell als auch im Tiermodell untersucht. Hierbei kommt das konfokale Laserscanning Mikroskop in verschiedenen Bereichen zum Einsatz. Beispiele sind das Ca2+ Imaging an Zellkulturzellen und an isolierten Glomeruli, oder die zytoskelettalen Veränderungen nach Stimulierung der Zellen in Zeitreihen über Nacht. [Verschiedene Projekte] Das Gerät wird routinemäßig für die Mikroskopie von Nierenschnitten eingesetzt, um die Verteilung von Fluoreszenzproteinen in Nieren transgener Mäuse sowohl in der Übersicht als auch im Detail beurteilen zu können. Für die Übersichtaufnahmen nutzen wir hierbei die automatische Stitching Funktion des Mikroskops, wozu der motorisierte Objekttisch benötigt wird. Weiterhin fand das Gerät Einsatz in zahlreichen Projekten zur Rolle von ziliärer Signaltransduktion bei der Pathogenese von Zystennieren. Dabei wurden überwiegend kultivierte, ziliierte Zelllinien untersucht.
Publications
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Dafinger C, Liebau MC, Elsayed SM, Hellenbroich Y, Boltshauser E, Korenke GC, Fabretti F, Janecke AR, Ebermann I, Nürnberg G, Nürnberg P, Zentgraf H, Koerber F, Addicks K, Elsobky E, Benzing T, Schermer B, Bolz HJ
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Nephrocystin-4 regulates Pyk2-induced tyrosine phosphorylation of nephrocystin-1 to control targeting to monocilia. J Biol Chem. (2011), 286(16), 14237-45
Liebau MC, Höpker K, Müller RU, Schmedding I, Zank S, Schairer B, Fabretti F, Höhne M, Bartram MP, Dafinger C, Hackl M, Burst V, Habbig S, Zentgraf H, Blaukat A, Walz G, Benzing T, Schermer B
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NPHP4, a cilia-associated protein, negatively regulates the Hippo pathway. J Cell Biol. (2011), 193(4), 633-42
Habbig S, Bartram MP, Müller RU, Schwarz R, Andriopoulos N, Chen S, Sägmüller JG, Hoehne M, Burst V, Liebau MC, Reinhardt HC, Benzing T, Schermer B
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TCF/Lef1 activity controls establishment of diverse stem and progenitor compartments in mouse epidermis. EMBO J (2011), 30, 3004-3018
Petersson M, Brylka H, Kraus A, John S, Rappl G, Schettina P, Niemann C
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The BAR Domain Protein PICK1 Regulates Cell Recognition and Morphogenesis by Interacting with Neph Proteins. Mol Cell Biol (2011), 31, 3241– 3251
Höhne, M., Lorscheider, J., von Bardeleben, A., Dufner, M., Scharf, M. A., Godel, M., Helmstadter, M., Schurek, E.-M., Zank, S., Gerke, P., Kurschat, C., Sivritas SH, Neumann-Haefelin E, Huber TB, Reinhardt HC, Schauss AC, Schermer B, Fischbach KF, Benzing T
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Intrinsic proinflammatory signaling in podocytes contributes to podocyte damage and prolonged proteinuria. Am J Physiol Renal Physiol. (2012), 303(10), F1473-85
Brähler S, Ising C, Hagmann H, Rasmus M, Hoehne M, Kurschat C, Kisner T, Goebel H, Shankland S, Addicks K, Thaiss F, Schermer B, Pasparakis M, Benzing T, Brinkkoetter PT
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Stem cell dynamics in sebaceous gland morphogenesis in mouse skin. Dev Biol (2012), 363, 138-46
Frances D, Niemann C
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The centrosomal kinase Plk1 localizes to the transition zone of primary cilia and induces phosphorylation of nephrocystin-1. PLoS One (2012), 7(6), e38838
Seeger-Nukpezah T, Liebau MC, Höpker K, Lamkemeyer T, Benzing T, Golemis EA, Schermer B
