CLCA-Genfamilien beim Schwein
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Förderungszeitraum konnten alle sieben geplanten Ziele erfolgreich bearbeitet und erreicht werden: Die CLCA-Mitglieder beim Schwein wurden auf genomischer Ebene identifiziert, kloniert und auf molekularbiologischer und biochemischer Ebene ausführlich charakterisiert. Wie bei seinen orthologen Vertretern beim Menschen, hCLCA1, und beim Pferd, eCLCA1, konnten auch beim Schwein allelische Variationen im pCLCA1-Gen identifiziert werden. Das pCLCA3-Gen ist wie beim Menschen offenbar ein Pseudogen. Die CLCA-Mitglieder beim Schwein lassen sich proteinbiochemisch in die bekannten zwei Cluster einordnen: 1) Vollständig sezernierte CLCA-Proteine und 2) CLCA-Proteine mit carboxyterminaler Transmembrandomäne und sezerniertem Amino-Terminus. Es wurden für jeden CLCA-Vertreter spezifische Antikörper generiert und das organ- und zellspezifische Expressionsmuster wurden lichtmikroskopisch und anschließend mittels RT-PCR an Normalgeweben bestimmt. Dabei zeigte sich eine systemische Expression von pCLCA1 in Muzin-produzierenden Zellen, von pCLCA2 in Keratinozyten, von pCLCA4a in Epithelzellen des Respirations- und Darmtraktes und von pCLCA4b in Enterozyten. Im Hinblick auf das Expressionsmuster der CLCA-Proteine ist das Schwein dem Menschen ähnlicher als die Maus. Weiterhin konnte das Expressionsmuster des porcinen CFTR-Proteins bestimmt werden. Dazu wurden spezifische Antikörper gegen das porcine CFTR-Protein generiert. Auch hier ähnelt die CFTR-Expression beim Schwein weitestgehend dem des Menschen. Jedoch wurden auch Spezies-spezifische Unterschiede wie ein Fehlen der porcinen CFTR-Expression in den Hautdrüsen, der Niere und dem Gehirn identifiziert. Mit Hilfe des neuen antipCFTR-Antikörpers wurde auch das neue CF-Schweinemodell aus der Arbeitsgruppe um Wolf/Klymiuk charakterisiert. Von den porcinen CLCA-Vertretern zeigen pCLCA1, pCLCA4a und pCLCA4b ein überlappendes Gewebe- und zum Teil sogar zelluläres Expressionsmuster mit pCFTR. Die funktionelle elektrophysiologlsche Untersuchung wurde im Mausmodell adressiert, wobei eine Beteiligung der CLCA-Proteine an der Beeinflussung der Chloridleitfähigkeit in vivo im Gegensatz zu den bekannten in vitro-Daten fraglich ist. Als wichtiger neuer funktioneller Aspekt konnte gezeigt werden, dass es sich bei den CLCA-Proteinen um Metalloproteasen handelt, die in der Lage sind, sich selbst zu spalten. Zusätzlich zu den vorgesehenen Aspekten und der Funktion der CLCA-Proteine als Metalloproteasen wurden zwei weitere überraschende wie wesentliche Erkenntnisse gewonnen: 1) Das pCLCA4-Gen liegt als Genduplikatur in pCLCA4a und pCLCA4b beim Schwein vor. 2) Etwa 50% der Schweinepopulation tragen eine Mutation des pCLCA4b-Gens, die zu einer fehlenden Proteinexpression führt. Somit wurde ein natürlich vorkommender Knockout identifiziert, mit dem nun für zukünftige Studien ein Tool zur Verfügung steht, die Funktion der CLCA-Proteine weiter zu untersuchen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) Genomic, tissue expression, and protein characterization of pCLCA1, a putative modulator of cystic fibrosis in the pig. J Histochem Cytochem. 57(12):1169-81
Plog S, Mundhenk L, Klymiuk N, Gruber AD
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(2010) Tissue and cellular expression patterns of porcine CFTR: similarities to and differences from human CFTR. J Histochem Cytochem. 58(9):785-97
Plog S, Mundhenk L, Bothe MK, Klymiuk N, Gruber AD
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(2011) The murine goblet cell protein mCLCA3 is a zinc-dependent metalloprotease with autoproteolytic activity. Mol Celis. 32(6):535-41
Bothe MK, Mundhenk L, Kaup M, Weise C, Gruber AD
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(2012) Impaired autoproteolytic cleavage of mCLCA6, a murine integral membrane protein expressed in enterocytes, leads to cleavage at the plasma membrane instead of the endoplasmic reticulum. Mol Cells. 33(3):251-7
Bothe MK, Mundhenk L, Beck CL, Kaup M, Gruber AD
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(2012) mCLCAS does not contribute to calcium-activated chloride conductance in murine ainways. Am J Respir Cell Mol Biol. 47(1):87-93
Mundhenk L, Johannesson B, Anagnostopoulou P, Braun J, Bothe MK, Schultz C, Mall MA, Gruber AD
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(2012) Synthesis of porcine pCLCA2 protein during late differentiation of keratinocytes of epidermis and hair follicle inner root sheath. Cell Tissue Res. 350(3):445-53
Plog S, Mundhenk L, Langbein L, Gruber AD
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(2012) The porcine chloride channel calcium-activated family member pCLCA4a mirrors lung expression of the human hCLCA4. J Histochem Cytochem. 60(1):45-56
Plog S, Grötzsch T, Klymiuk N, Kobalz U, Gruber AD, Mundhenk L
