Untersuchung der funktionalen und strukturellen Interaktion zwischen transient receptor potential (TRP) Ionenkanälen und G-Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Rezeptoren aus der Familie der transient receptor potential (TRP) Ionenkanäle wirken als molekulare Sensoren und werden durch unterschiedlichste physikalische und/oder chemische Reize aktiviert. Nach dem klassischen Verständnis leiten aktivierte Rezeptoren/Ionenkanäle ihr Signal in Form von Ionenströmen in die Zelle und führen so primär zur Änderung des Membranpotentials. Im Rahmen des beantragten Versuchsvorhabens konnten wir zeigen, dass der Kälte- und Mentholrezeptor TRPM8 strukturell und funktionell mit Gαq interagieren und somit neben der klassischen ionotropen Signalleitung, auch einen G-Protein-gekoppelten metabotropen Signalweg aktivieren kann. So gelang es uns zu zeigen, dass die Aktivierung von TRPM8 mit Menthol oder Kälte zu einem intrazellulären Ca2+-Signal führt, obwohl unter extrazellulär Ca2+-freien Bedingungen ein Flux von Ca2+ Ionen von außen in die Zelle hinein ausgeschlossen werden konnte. Dieses metabotrope TRPM8-vermittelte und Menthol-induzierte Ca2+-Signal zeigte auch eine klare PLC-, so wie Gαq-Abhängigkeit, da das Signal durch die PLC Inhibitoren U73122 oder Edelfosine, sowie durch Überexpression eines dominant-negativen Gαq Proteins (GαqX) verhindert werden konnte. Die Hypothese der metabotropen TRPM8-Signalkaskade konnten wir durch weitere Befunde stärken die zeigen, dass Menthol in TRPM8-exprimierenden Zellen zu einer G-Proteinaktivierung führt. Diese G-Proteinaktivierung konnte zum einen über die Bindung von radioaktiv markiertem GTPγ[35S] an Gαq nachgewiesen werden, sowie über die Menthol-induzierte Dissoziation des heterotrimeren G-Proteinkomplexes. Weitere Hinweise für eine direkte Protein/Protein-Interaktion konnten in FRET Experimenten mit coexprimiertem TRPM8-CFP und Gαq-YFP gewonnen werden. Diese Befunde konnten in einem Ansatz mit Hilfe von FRAP Experimenten bestätigt werden, wobei die Mobilität eines fluoreszenzmarkierten Proteins (Gαq-YFP) in der Zelle in Abhängigkeit eines zweiten Proteins (TRPM8 oder andere Ionenkanäle/Rezeptoren) analysiert wird. Weiterhin gelang uns die Lokalisation der G-Protein-Bindestelle am TRPM8-Rezeptor auf den C-Terminus des Proteins einzugrenzen. Somit haben unsere Ergebnisse haben maßgeblich zum grundlegenden Verständnis der Funktionsweise von TRP Rezeptoren und der Modulation komplexer intrazellulärer Signalwege beigetragen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The TRPM8 ion channel comprises direct Gq protein-activating capacity. Pflugers Arch, 2012. 463(6): p. 779-97
Klasen, K., Hollatz, D., Zielke, S., Gisselmann, G., Hatt, H., and Wetzel, C.H.
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Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nat Commun, 2013. 4: p. 2179
Tang, Z., Kim, A., Masuch, T., Park, K., Weng, H., Wetzel, C., and Dong, X.
