Die Proteasom-katalysierte Eliminierung fehlgefalteter Proteine im Zytoplasma der Hefezelle: Die Funktion von Chaperonen und anderen Helfern
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Fehlgefaltete Proteine stellen eine große Gefahr für das Leben einer Zelle dar. Ihre Aggregation hat starke negative Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie. Sie müssen deshalb erkannt und effizient eliminiert werden. Eine Ursache vieler schwerwiegender menschlicher Erkrankungen (Neurodegeneration, Diabetes, Krebs) liegt in der fehlerhaften Eliminierung von Proteinmüll. Zu seiner effizienten Eliminierung besitzt die Eukaryontenzelle spezifische Erkennungssysteme in jedem zellulären Kompartiment. Hier studierten wir die Erkennung und Entfernung von fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma der Zelle. Als Modellorganismus einer Eukaryontenzelle verwendeten wir die Hefe "Saccharomyces cerevisiae". Mit Hilfe einer ER-Import defekten mutierten vakuolären Carboxypeptidase Y, auch fusioniert mit GFP, ( delta-ssCPY*; delta-ssCPY*-GFP) konnte gezeigt werden, dass Hsp70 und Hsp40 Chaperone (Ssa1, Ydj1) für die Entfernung des fehlgefalteten Proteins notwendig sind. Sie halten zudem delta-ssCPY*-GFP löslich und können präzipitiertes Protein auflösen. Die Eliminierung benötigt das Ubiquitin-Proteasom System, dem es wahrscheinlich Chaperon-abhängig zugeführt wird. Die Identität der für die Ubiquitinierung notwendigen zytoplasmatischen Ubiquitin Ligase (E3) war eine Überraschung: mit Hilfe eines genetischen Screens und biochemischem "back up" unter Verwendung des Substrats delta-ssCPY*-Leu-myc entpuppte sich die N-end rule Ligase Ubr1 als das zentrale E3 Enzym, welches die Ubiquitinierung des Substrats zu seinem proteasomalen Abbau katalysiert. Ferner wurden die mit dem humanen DJ-1 orthologen Hsp31 Chaperone der Hefe als notwendig für den Abbau des Substrats unter Nahrungslimitierung gefunden. Ihre genaue Funktion im Abbauprozess ist noch unklar. Es könnte sein, dass sie u.a. für die Bereitstellung von Hsp70 Chaperonen der Ssa Klasse benötigt werden, die essentiell für den Abbau sind. Interessanterweise wurde ein zweigeteilter Abbau fehlgefalteter Proteine des Zytoplasmas beobachtet: Ein Teil wird über die zytoplasmatische Ubr1 Ligase ubiquitiniert und dann proteasomal abgebaut, ein anderer Teil wird über die nukleäre Ligase San1 getriggert, durch das Proteasom eliminiert. Wir konnten zeigen, dass eine Determinante für den Abbau in den verschiedenen Kompartimenten die molekulare Masse ist: kleine fehlgefaltete Proteine gelangen in den Zellkern zum San1 getriggerten Abbau, große fehlgefaltete Proteine verbleiben im Zytoplasma zum Ubr1 getriggerten Abbau. Anhand des Fettsäuresynthase Komplexes Fas1 6 Fas2 6 konnten wir nachweisen, dass die Regulation der Stöchiometrie heterologer Proteinkomplexe auch der selektiven Proteolyse unterliegt. So wird bei Fehlen der Fas1 Untereinheit die "orphan" Fas2 Untereinheit Ubiquitin-Proteasom abhängig eliminiert. Die zentrale Ubiquitin Ligase des Prozesses ist Ubr1. Das Hsp70 Chaperon Ssa1 und nachfolgend der Cdc48 ATPase Motor sind weitere essentielle Komponenten des Abbaus.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2007) The cytoplasmic Hsp70 chaperone machinery subjects misfolded and ER import incompetent proteins to degradation via the ubiquitin-proteasome system. Molecular Biology of the Cell (MBoC), Vol. 18. 2007, no. 1, pp. 153-165.
Park, S-H., Bolender, N., Eisele, F., Kostova, Z., Takeuchi, J., Coffino, P. and Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1091/mbc.E06-04-0338) - (2008) Degradation of misfolded protein in the cytoplasm is mediated by the ubiquitin ligase Ubr1. FEBS Letters, Vol. 582. 2008, Issue 30, pp. 4143–4146.
Eisele, F., Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2008.11.015) - (2008) ER-associaled protein degradation: The function of Hul5 in fragment-specific substrate elimination. J. Biol. Chem., 283, 16374-16383
Kohlmann, S., Schäfer, A. and Wolf, D.H.
- (2008) The yeast GID complex, a novel ubiquitin ligase (E3) involved in the regulation of carbohydrate metabolism. Mol. Biol. Cell, 19, 3323-3333
Santi, O., Pfirrmann, T., Braun, B., Jurelschke, J., Kimmig, P., Scheel, H., Hofmann, K., Thumm, M. and Wolf, D.H.
- (2009) Sec61 is part of the endoplasmic reticulum associated degradation machinery, EMBO J., 28,2874-2884
Schäfer, A. and Wolf, D.H.
- (2009) Ubx4 modulates Cdc48 activity and influences degradation of misfolded proteins of the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 284, 16082-16089
Alberts, S.M., Sonntag, C, Schäfer, A. and Wolf, D.H.
- (2010) Dfm1 forms distinct complexes with Cdc48 and the ER ubiquitin ligases and is required for ERAD, Traffic 11, 1363-1369
Stolz, A. and Wolf, D.H.
- (2010) The Cdc48-Ufd1-Npl4 complex is central in ubiquitin-proieasome triggered catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase, Biochem. Biophys. Res. Comm. 394, 335-341
Barbin, L., Eisele, F., Santi, O. and Wolf, D.H.
- (2010) The Hsp70 chaperone Ssa1 is essential for catabolite induced degradation of the gluconeogenic enzyme fructose-1,6-bisphosphatase, Biochem. Biophys. Res. Comm., 397, 447-452
Jurelschke, J., Menssen, R., Sickmann, A. and Wolf, D.H.
- (2011) Gid9, a second RING finger protein contributes to the ubiquitin ligase activity of the Gid complex required for catabolite degradation, FEBS Lett. 585, 3856-3861
Braun, B. Pfirrmann, T., Menssen, R., Hofmann, K., Scheel, H. and Wolf, D.H.
- (2011) Mnl2 a novel component of the ER associated protein degradation pathway, Biochem. Biophys. Res. Comm. 414, 528-532
Martinez Benitez, E., Stolz, A., Becher, A. and Wolf D.H.
- (2011) Yos9 a control protein for misfolded glycosylated and non-glycosylatedproteins in ERAD, FEBS Lett. 585. 3015-3019
Martinez Benitez, E., Stolz, A. and Wolf, D.H.
- (2012) Exploring the topology of the Gid complex, the E3 ubiquitin ligase involved in cataboliteinduced degradation of gluconeogenic enzymes. J. Biol. Chem. 287, 25602-25614
Menssen, R., Schweiggerl, J., Schreiner, J., Kusevic, D., Reulher, J., Braun, B. and Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/jbc.M112.363762) - (2013) Previously unknown role for the ubiquitin ligase Ubr1 in endoplasmic reticulum-associated protein degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 15271-15276
Stolz, A., Besser, S., Hottmann, H., and Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1073/pnas.1304928110) - (2015) Absence of the yeast Hsp31 chaperones of the DJ-1 superfamily perturbs cytoplasmic protein quality control in late growth phase. PLoS One, Vol. 10. 2015, Issue 10: e0140363.
Amm, I., Norell, D., and Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0140363) - (2015) Quality control of a cytoplasmic protein complex. Chaperone motors and the ubiquitin-proteasome system govern the fate of orphan fatty acid synthase subunit Fas2 of yeast. Journal of Biological Chemistry, Vol. 290. 2015, pp. 4677-4687.
Scazzari, M., Amm, I., and Wolf, D.H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/jbc.M114.596064)
