Die Proteasom-katalysierte Eliminierung fehlgefalteter Proteine im Zytoplasma der Hefezelle: Die Funktion von Chaperonen und anderen Helfern
Final Report Abstract
Fehlgefaltete Proteine stellen eine große Gefahr für das Leben einer Zelle dar. Ihre Aggregation hat starke negative Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie. Sie müssen deshalb erkannt und effizient eliminiert werden. Eine Ursache vieler schwerwiegender menschlicher Erkrankungen (Neurodegeneration, Diabetes, Krebs) liegt in der fehlerhaften Eliminierung von Proteinmüll. Zu seiner effizienten Eliminierung besitzt die Eukaryontenzelle spezifische Erkennungssysteme in jedem zellulären Kompartiment. Hier studierten wir die Erkennung und Entfernung von fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma der Zelle. Als Modellorganismus einer Eukaryontenzelle verwendeten wir die Hefe "Saccharomyces cerevisiae". Mit Hilfe einer ER-Import defekten mutierten vakuolären Carboxypeptidase Y, auch fusioniert mit GFP, ( delta-ssCPY*; delta-ssCPY*-GFP) konnte gezeigt werden, dass Hsp70 und Hsp40 Chaperone (Ssa1, Ydj1) für die Entfernung des fehlgefalteten Proteins notwendig sind. Sie halten zudem delta-ssCPY*-GFP löslich und können präzipitiertes Protein auflösen. Die Eliminierung benötigt das Ubiquitin-Proteasom System, dem es wahrscheinlich Chaperon-abhängig zugeführt wird. Die Identität der für die Ubiquitinierung notwendigen zytoplasmatischen Ubiquitin Ligase (E3) war eine Überraschung: mit Hilfe eines genetischen Screens und biochemischem "back up" unter Verwendung des Substrats delta-ssCPY*-Leu-myc entpuppte sich die N-end rule Ligase Ubr1 als das zentrale E3 Enzym, welches die Ubiquitinierung des Substrats zu seinem proteasomalen Abbau katalysiert. Ferner wurden die mit dem humanen DJ-1 orthologen Hsp31 Chaperone der Hefe als notwendig für den Abbau des Substrats unter Nahrungslimitierung gefunden. Ihre genaue Funktion im Abbauprozess ist noch unklar. Es könnte sein, dass sie u.a. für die Bereitstellung von Hsp70 Chaperonen der Ssa Klasse benötigt werden, die essentiell für den Abbau sind. Interessanterweise wurde ein zweigeteilter Abbau fehlgefalteter Proteine des Zytoplasmas beobachtet: Ein Teil wird über die zytoplasmatische Ubr1 Ligase ubiquitiniert und dann proteasomal abgebaut, ein anderer Teil wird über die nukleäre Ligase San1 getriggert, durch das Proteasom eliminiert. Wir konnten zeigen, dass eine Determinante für den Abbau in den verschiedenen Kompartimenten die molekulare Masse ist: kleine fehlgefaltete Proteine gelangen in den Zellkern zum San1 getriggerten Abbau, große fehlgefaltete Proteine verbleiben im Zytoplasma zum Ubr1 getriggerten Abbau. Anhand des Fettsäuresynthase Komplexes Fas1 6 Fas2 6 konnten wir nachweisen, dass die Regulation der Stöchiometrie heterologer Proteinkomplexe auch der selektiven Proteolyse unterliegt. So wird bei Fehlen der Fas1 Untereinheit die "orphan" Fas2 Untereinheit Ubiquitin-Proteasom abhängig eliminiert. Die zentrale Ubiquitin Ligase des Prozesses ist Ubr1. Das Hsp70 Chaperon Ssa1 und nachfolgend der Cdc48 ATPase Motor sind weitere essentielle Komponenten des Abbaus.
Publications
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