Untersuchung eines erweiterten Interaktionsspektrums des Thyrotropin Rezeptors
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Aktivierung des TSHR durch TSH ist der entscheidende Schritt für die Initiierung der Schilddrüsenhormonsynthese. Der TSHR koppelt an alle vier G-Protein Sub-Familien, allerdings wird die maßgebliche Rolle für Wachstum und Funktion der Schilddrüse der Aktivierung des Gs/Adenylatzyklase-Weges zugesprochen. Über die letzten Jahre häufen sich aber die Anzeichen, dass auch der Gq/11 Weg eine nicht zu vernachlässigende Rolle spielt. Daher war die Fragestellung in der ersten Förderperiode auf die Untersuchung der physiologischen Relevanz des dualen Signalisierens, sowie der Nachweis der molekularen Strukturen und Mechanismen, die dafür verantwortlich sind, gerichtet. Durch die Untersuchung einer Reihe von natürlich vorkommenden Mutationen konnte gezeigt werden, dass es in der Tat Unterschiede in der Ausprägung des Schilddrüsenphänotyps in Abhängigkeit der Signalwegaktivierung gibt. Liegt eine Mutation vor, die zur konstitutiven Signalisierungen von Gs führt, den Gq/11 Signalweg jedoch unbeeinflusst lässt, oder ebenfalls erhöht (z.B. C636R), ist das Schilddrüsenwachstum sehr viel ausgeprägter, als wenn nur der Gs Weg konstitutiv aktiviert und der Gq/11 Weg insgesamt inaktiviert ist (z.B. C636W). Dieses Beispiel zeigt, dass die Seitenketten und die räumliche Lokalisation einer Aminosäure entscheidend sein können, welchen Aktivitätszustand der TSHR einnimmt. Mit den Ergebnissen der ersten Förderperiode konnte wir belegen, dass das duale Signalisieren von phänotypischer Relevanz für TSHR-Mutationsträger ist. Ferner haben wir tiefere Einblicke über die Mechanismen erhalten, die für die Aufrechterhaltung der inaktiven Rezeptorkonformation notwendig sind. Kleinste Veränderungen an dieser Rezeptorkonformation, z.B. in TM6, führen zur Daueraktivität des Rezeptors. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass diese auch selektiv nur einen Signalweg betreffen kann. Weiterhin konnte zum ersten Mal eine TSHR Mutation in TM6 identifiziert werden, die zu einer völligen Inaktivierung des Rezeptors führt. Dieser Befund belegt, dass insbesondere die Art des Aminosäureaustausches entscheidend ist, in welcher Konformation der TSHR vorliegt. Diese Studien haben viele Details zur Beantwortung der Frage nach der Phänotyp- Genotyp Korrelationen beigetragen. In Anlehnung an diese Untersuchungen zu konkreten, neuen, pathogenen TSHR-Veränderungen sind auch weiterführend grundlegende molekularbiologische und strukturelle Fragen zum TSHR untersucht worden, bezüglich der Ligandenbindung, der Signaltransduktion und der G-Protein Aktivierung. Damit sind entscheidende Schritte präsentiert worden, welche zum Verständnis dieses Rezeptors allgemein, aber auch der pathogenen Mechanismen beigetragen haben. Es ist zudem bekannt, dass der TSHR homo-oligomerisieren kann und dass dies einen Einfluss auf die TSH-Bindung und die Signalisierung hat (negative Cooperativität). Allerdings war bisher für den TSHR nicht nachgewiesen worden, dass die Interaktion mit anderen Proteinen, die nicht direkt die Aktivierung des Rezeptors (wie bei TSH, Thyrostimulin, Autoantikörper) oder die Signalisierung (wie bei G- Proteinen, Arrestin) betreffen, eine Einfluss auf die Funktionalität des TSHR haben. In der zweiten Förderperiode wurde nach potentiellen weiteren Interaktionspartnern des TSHR gesucht, auch, da bekannt ist von anderen GPCRs, dass solche „Begleitproteine“ (Interaktom) relevanten Einfluß haben können auf die GPCR Eigenschaften. Hier wurden zum einen potentielle Interaktionspartner getestet, welche wie der TSHR auf der basolateralen Membran des Rezeptors lokalisiert sind (ADORA2A und MCT8), und es wurde ungerichtet mittels bimolekularer Fluoreszenzkomplementation nach neuen Interaktionspartnern gescreent. Für den ADORA2A und den MCT8 konnte eine Interaktion nachgewiesen werden. Im Screen konnte ein molekulares Chaperon, GRP94, als Interaktionspartner identifiziert werden. Das Ziel der dritten Förderperiode war die Charakterisierung der identifizierten Interaktionen. Hier konnte bisher für die Interaktion mit MCT8 eine Beeinflussung der TSHR Funktion hinsichtlich einer Reduktion der Gq/11 Aktivierung nachgewiesen werden. Die Ko-Expression mit GRP94 verstärkt die Gesamt-TSHR Expression und auch die Expression auf der Zelloberfläche. Bemerkenswerterweise hat dies jedoch keinen Einfluss auf die Gs/Adenylatzyklase Signalisierung. Die Signalisierung über Gq/11 wird jedoch auf das fünffache gesteigert. Zusammenfassend konnten in diesem Projekt neue Erkenntnisse über die Mechanismen des duales Signalisierens des TSHR ermittelt und deren physiologische Bedeutung nachgewiesen werden. In Interaktionsstudien konnten erstmals TSHR Interaktionspartner identifiziert werden, die eine Bedeutung in der Funktion des TSHR haben, wobei hier eine besondere Bedeutung der Gq/11 Signalisierung zugesprochen werden kann.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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A new phenotype of nongoitrous and nonautoimmune hyperthyroidism caused by a heterozygous thyrotropin receptor mutation in transmembrane helix 6.J Clin Endocrinol Metab. 2010 Aug;95(8):3605-10
Winkler F, Kleinau G, Tarnow P, Rediger A, Grohmann L, Gaetjens I, Krause G, L'Allemand D, Grüters A, Krude H, Biebermann H
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An interactive web-tool for molecular analyses links naturally occurring mutation data with three-dimensional structures of the rhodopsinlike glycoprotein hormone receptors. Hum Mutat. 2010 Jun;31(6):E1519-25
Kleinau G, Kreuchwig A, Worth CL, Krause G
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Genetic defects, thyroid growth and malfunctions of the TSHR in pediatric patients. Front Biosci (Landmark Ed). 2010 Jun 1;15:913-33
Biebermann H, Winkler F, Kleinau G
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Principles and determinants of G-protein coupling by the rhodopsin-like thyrotropin receptor. PLoS One. 2010 Mar 18;5(3):e9745
Kleinau G, Jaeschke H, Worth CL, Mueller S, Gonzalez J, Paschke R, Krause G
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Defining structural and functional dimensions of the extracellular thyrotropin receptor region. J Biol Chem. 2011 Jun 24;286(25):22622-31
Kleinau G, Mueller S, Jaeschke H, Grzesik P, Neumann S, Diehl A, Paschke R, Krause G
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From molecular details of the interplay between transmembrane helices of the thyrotropin receptor to general aspects of signal transduction in family a G-protein-coupled receptors (GPCRs). J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):25859-71
Kleinau G, Hoyer I, Kreuchwig A, Haas AK, Rutz C, Furkert J, Worth CL, Krause G, Schülein R
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Molecular description of non-autoimmune hyperthyroidism at a neonate caused by a new thyrotropin receptor germline mutation. Thyroid Res. 2011 Aug 3;4 Suppl 1:S8
Biebermann H, Winkler F, Handke D, Grüters A, Krude H, Kleinau G
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Extended and structurally supported insights into extracellular hormone binding, signal transduction and organization of the thyrotropin receptor. PLoS One. 2012;7(12):e52920
Krause G, Kreuchwig A, Kleinau G
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New pathogenic thyrotropin receptor mutations decipher differentiated activity switching at a conserved helix 6 motif of family A GPCR. J Clin Endocrinol Metab. 2012 Feb;97(2):E228-32
Biebermann H, Winkler F, Handke D, Teichmann A, Gerling B, Cameron F, Eichhorst J, Grüters A, Wiesner B, Kühnen P, Krude H, Kleinau G
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Novel insights on thyroidstimulating hormone receptor signal transduction. Endocr Rev. 2013 Oct;34(5):691-724
Kleinau G, Neumann S, Grüters A, Krude H, Biebermann H
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Constitutive activities in the thyrotropin receptor: regulation and significance. Adv Pharmacol. 2014;70:81-119
Kleinau G, Biebermann H
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Loss-of- Function Variants in a Hungarian Cohort Reveal Structural Insights on TSH Receptor Maturation and Signaling. J Clin Endocrinol Metab. 2015 Jul;100(7):E1039-45
Lábadi Á, Grassi ES, Gellén B, Kleinau G, Biebermann H, Ruzsa B, Gelmini G, Rideg O, Miseta A, Kovács GL, Patócs A, Felszeghy E, Nagy EV, Mezősi E, Persani L
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Detection of Novel Gene Variants Associated with Congenital Hypothyroidism in a Finnish Patient Cohort. Thyroid. 2016 Sep;26(9):1215-24
Löf C, Patyra K, Kuulasmaa T, Vangipurapu J, Undeutsch H, Jaeschke H, Pajunen T, Kero A, Krude H, Biebermann H, Kleinau G, Kühnen P, Rantakari K, Miettinen P, Kirjavainen T, Pursiheimo JP, Mustila T, Jääskeläinen J, Ojaniemi M, Toppari J, Ignatius J, Laakso M, Kero J
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Minireview: Insights Into the Structural and Molecular Consequences of the TSH-β Mutation C105Vfs114X. Mol Endocrinol. 2016 Sep;30(9):954-64
Kleinau G, Kalveram L, Köhrle J, Szkudlinski M, Schomburg L, Biebermann H, Grüters-Kieslich A
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Oligomerization of GPCRs involved in endocrine regulation. J Mol Endocrinol. 2016 Jul;57(1):R59-80
Kleinau G, Müller A, Biebermann H
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Evidence of G-protein coupled receptor and substrate transporter heteromerization at a single molecule level, Cell Mol Life Sci. 2017 Dec 30
Fischer J, Kleinau G, Rutz C, Zwanziger D, Khajavi N, Müller A, Rehders M, Brix K, Worth CL, Führer D, Krude H, Wiesner B, Schülein R, Biebermann H
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Structural-Functional Features of the Thyrotropin Receptor: A Class A G-Protein-Coupled Receptor at Work. Front Endocrinol (Lausanne). 2017 Apr 24;8:86
Kleinau G, Worth CL, Kreuchwig A, Biebermann H, Marcinkowski P, Scheerer P, Krause G
