Durchflusszytometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Wir nutzen das bewilligte Durchflusszytometer im Rahmen diverser Projekte v.a. für die Charakterisierung von Herzzellen sowie pluripotenten Stammzellen. Dabei wird einerseits die Zusammensetzung nativer Herzzellpopulationen (mit Hauptaugenmerk auf dem Anteil von Herzmuskelzellen und Fibroblasten) als auch von undifferenzierten (sogenannte stemness marker) wie differenzierten (endodermale, ektodermale und mesodermale Marker) Stammzellkulturen untersucht. Im Folgenden sind beispielhaft Daten aus publizierten Originalarbeiten zusammengefasst: In Tiburcy et al. 2011 (Circ Res) haben wir die Zusammensetzung von künstlichem Herzgewebe (sogenannte Engineered Heart Muscle – EHM) hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung nach Herstellung aus enzymatisch isolierten Zellen aus neonatalen Rattenherzen untersucht. Dabei wurde deutlich, dass der Herzmuskelanteil in EHM unmittelbar nach Herstellung auf etwa 20% der Input Herzmuskelzellmenge abfällt. Im Gegensatz dazu bleibt der Fibroblastenanteil konstant. Während Herzmuskelzellen in EHM in etwa 5% der Fälle eine Zellzyklusaktivität zeigten, war diese in etwa 10% der Fibroblasten nachweisbar, wobei es in keinem Fall zu einer Zellvermehrung (Zytokinese) gekommen ist, sondern in Herzmuskelzellen Karyokinese ohne Hinweis auf Zytokinese nachgewiesen werden konnte. In Soong et al. 2012 (Curr Protoc Cell Biol) haben wir per Durchflusszytometrie Herzmuskelzellen nach Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen identifiziert und quantifiziert. Im Rahmen aktueller nicht publizierter Untersuchungen zur Differenzierung und Maturierung von humanen Herzmuskelzellen aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen nutzen wir die Durchflusszytometrie routinemäßig, um die Qualität der Herzmuskelzellaufreinigung zu bestimmen und dabei zugleich zelluläre Kontaminationen zu identifizieren. In Didié et al. 2013 (J Clin Invest) haben wir den Herzmuskelzellanteil nach Differenzierung von murinen embryonalen und parthenogenetischen Stammzellen mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Dabei zeigte sich als interessanter Befund kein ersichtlicher Unterschied in der Herzmuskelzell Differenzierungskapazität in biparenteralen und rein maternalen pluripotenten Stammzellen trotz klarer epigenetischer Unterschiede. Zurzeit charakterisieren wir parthenogenetische Stammzellen hinsichtlich immunologischer Eigenschaften und verwenden dabei intensiv die Durchflusszytometrie. In Zafiriou et al. 2014 (Stem Cells) wurde die Durchflusszytometrie genutzt, um in Erythropoetin-Rezeptor (EPOR) exprimierenden Zellen des Herzens einerseits die Expression/Aktivität von Herzmuskelzellmarkergenen (alpha-actinin/alpha-myosin heavy chain [MHC]) zu überprüfen und + + gleichzeitig die Zellzyklusaktivität zu bestimmen. Diese Daten legen nahe, dass myokardiale EPOR /MHC Zellen eine proliferierende Herzzellpopulation mit möglicherweise regenerativem Potential darstellen. Darüber hinaus führen wir Untersuchungen mit differenziell transgen (GFP und RFP) markierten Herzmuskelzellen und Fibroblasten zur Herstellung von EHM durch. Die transgene Markierung erlaubt schließlich eine Zelltyp-spezifische Analyse von Zellmorphologie, Transkriptom und Proteom. Über diesen Ansatz beabsichtigen wir die Interaktion von Herzmuskelzellen und Fibroblasten im kranken und gesunden Herzen besser zu verstehen (SFB 1002 C04). Im Rahmen der Anwendung von EHM für die Reparatur von defektem Herzgewebe nutzen wir die Durchflusszytometrie für die Qualitätskontrolle der verwendeten Zellen, um einerseits einen möglichen Anteil teratogener Zellen bereits ex vivo zu identifizieren und andererseits die Auswirkung biomechanischer und pharmakologischer Stimuli auf die Herzmuskeldifferenzierung zu untersuchen. Im Rahmen unserer Arbeiten zur Differenzierung von Herzmuskelgewebe aus menschlichen pluripotenten Stammzellen haben wir darüber hinaus Differenzierungsprotokolle für die neuronale und hepatische Gewebedifferenzierung entdeckt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2011) Terminal Differentiation, Advanced Organotypic Maturation, and Modeling of Hypertrophic Growth in Engineered Heart Tissue. Circ Res. 109:1105-1114
Tiburcy M, Didié M, Boy O, Christalla P, Doeker S, Naito H, Karikkineth BC, El-Armouche A, Grimm M, Nose M, Eschenhagen T, Zieseniss A, Katschinski D, Hamdani N, Linke WA, Yin X, Mayr M, Zimmermann WH
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(2012) Cardiac Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and their Assembly into Engineered Heart Muscle. Curr Protoc Cell Biol 55:23.8.1-23.8.21
Soong PL, Tiburcy M, Zimmermann WH
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(2012) Krueppel-like factor 15 regulates Wnt/ß-catenin transcription and controls cardiac progenitor cell fate in the postnatal heart. EMBO Mol Med 4:992-1007
Noack C, Zafiriou MP, Schaeffer HJ, Renger A, Pavlova E, Dietz R, Zimmermann WH, Bergmann MW, Zelarayán LC
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(2013) Parthenogenetic Stem Cells for Tissue Engineered Heart Repair. J Clin Invest 123:1285-1298
Didié M, Christalla P, Rubart M, Muppala V, Döker S, Unsöld B, El-Armouche A, Rau T, Eschenhagen T, Schwoerer AP, Ehmke H, Schumacher U, Fuchs S, Lange C, Becker A, Tao W, Scherschel JA, Soonpaa MH, Yang T, Lin Q, Zenke M, Han DW, Schöler HR, Rudolph C, Steinemann D, Schlegelberger B, Kattman S, Witty A, Keller G, Field LJ, Zimmermann WH
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(2013) The Four and a Half LIM-domain (FHL) 2 Controls Early Cardiac Cell Commitment and Expansion via Regulating ß-catenin-Dependent Transcription. Stem Cells. 31:928-940
Renger A, Zafiriou MP, Noack C, Pavlova E, Becker A, Sharkova K, Bergmann MW, El-Armouche A, Zimmermann WH, Zelarayán LC
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(2014) Erythropoietin responsive cardiomyogenic cells contribute to heart repair post myocardial infarction. Stem Cells. May 8
Zafiriou MP, Noack C, Unsöld B, Didie M, Pavlova E, Fischer HJ, Reichardt HM, Bergmann MW, El-Armouche A, Zimmermann WH, Zelarayan LC
