Untersuchungen zur Hyperphosphorylierung von Paratarg-7, einer häufigen antigenen Zielstruktur von Paraproteinen bei Plasmozytomen und MGUS
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Ursache für die Vererbung der Paratarg-7-Phosphorylierung liegt mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit im Bereich 4q35 des humanen Genoms (Ergebnis der Kopplungsanalyse). - Vergleichende Sequenzierungen dieses Bereiches ergaben jedoch keine gemeinsamenUnterschiede zwischen gesunden Probanden und Merkmalträgern. Unterschiede der DNA-Sequenzen zur humanen Datenbank in diesem Bereich waren individualspezifisch und konnten nicht dem Phänotyp wt-P7 bzw. mu-P7 zugeordnet werden. - DNA-Transfer-Experimente gefolgt von einer Analyse des Paratarg-7 Phosphorylierungszustandes zeigten, dass es innerhalb der genomischen Region 4q35 Teilbereiche gibt, die die Paratarg-7-Phosphorylierung verändern. Diese für die Paratarg-7 Phosphorylierung verantwortlichen zwei Teilbereiche konnten einerseits auf 37 bp und andererseits auf 120 bp eingegrenzt werden. Dabei wurde die Paratarg-7 Phosphorylierung abhängig vom sense bzw. anti-sense-Strang der DNA moduliert. - Diese 37 bp entsprechen dem Exon 2 einer hypothetischen lncRNA. Diese konnte in ihren vorhergesagten Strukturen(3 Splicingvarianten) nicht nachgewiesen werden; weder durch PCR noch durch shRNA vermittelten Knock-out. Daraus folgern wir, dass die vorhergesagte lncRNA entweder nicht existiert oder die vorhergesagten Strukturen falsch sind. Die ebenfalls die Paratarg-7 Phosphorylierung modulierende 120 bp entsprechen dem Exon 4 der Caspase-3. - Mit diesen 37 bp konnten bei wt-P7 Probanden 2 RNAs, bei mu-P7 Probanden mit hyperphosphorylierten Paratarg-7 nur eine RNA nachgewiesen werden. Diese RNAs konnten bisher nicht genau charakterisiert werden; die im Northern-Blot nachgewiesenen Banden hatten eine Größe von ca. 1,5 kb und entsprechen somit nicht der vorhergesagten Längen der 3 möglichen lncRNA-Varianten, was ebenfalls auf falsche Vorhersagen hindeutet. - Versuche in Gegenwart von miRNA-Inhibitoren deuten auf eine Beteiligung von miRNA hin. Damit könnten sowohl die in Patientenmaterial fehlende RNA als auch die durch Oligonukleotide beeinflusste Paratarg-7 Phosphorylierung erklärt werden. - Die Zusammensetzung der in den EMSA-Experimenten nachgewiesenen RNA/Protein-Komplexe konnte massenspektroskopisch nicht geklärt werden (Mengenproblem?).
