Einfluss der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur auf die Genotoxin-Sensitivität von Zellen gegenüber chlorethylierenden Zytostatika
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Chlornitrosoharnstoffe (CNU), zu denen für die Glioblastom-Therapie relevanten Zytostatika Nimustin (ACNU) und Lomustin (CCNU) gehören, wirken zytotoxisch auf Tumorzellen durch Induktion von DNA-Schäden. Zu den toxischsten DNA-Schäden gehören die DNA- Doppelstrangbrüche (DSB), die als Folge der Reparatur von DNA-Interstrangvernetzungen (ICL) entstehen und Apoptose/Nekrose oder Seneszenz auslösen können. Es sind zwei Hauptwege zur DNA-DSB-Reparatur bekannt, die homologe Rekombination (HR) und die nicht-homologe Strangverknüpfung (Non-Homologous-End-Joining, NHEJ). Im Rahmen des vorliegenden Projektes wurden die folgenden Fragenstellungen untersucht: 1) Welche Rolle spielen die MGMT-Expression, die homologe Rekombination (HR) und die DSB- Reparatur in der Resistenz von Zellen (Zytotoxizität, Apoptose-/ Nekroseinduktion) gegen CNU? Hamsterzellen mit Defekten in der HR-Reparatur (BRCA2, Rad51D1 oder XRCC3-Mutanten) zeigten eine signifikant erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ACNU (Nimustin) im Vergleich zu den Wild-Typ-Zelllinien (WT) im Koloniebildung-Test, während die NHEJ-Mutanten eine ähnliche Sensitivität oder nur leichte Sensibilisierung aufwiesen. Die Bestimmung der Apoptose/Nekrose- Induktion im Annexin V-FITC/PI-Test (AV-PI) ergab eine signifikante Erhöhung der Zelltodraten bei HR-Mutanten, die hauptsächlich auf die Apoptose-Induktion zurückzuführen war. BRCA2 und XRCC3 –Mutanten, die mit dem funktionellen humanen MGMT-Gen transfiziert wurden, wurden resistent gegenüber ACNU. 2) Spielen HR und NHEJ eine Rolle in der gentoxischen Wirkung der CNU? Die HR-defekten Zellen (BRCA2, XRCC3 und RAD51D-Mutanten) wiesen spontan eine chromosomale Instabilität auf und reagierten hypersensitiv gegenüber ACNU im Vergleich zum WT. Die NHEJ-Mutanten, dagegen, waren empfindlicher nur gegenüber die höchsten getesteten Konzentrationen. Also korrelierte die CNU-induzierte Gentoxizität mit der Zytotoxizität in den Zelllinien. 3) Wie erfolgt die Bildung und Reparatur der induzierten DSB im „Wildtyp“ und Reparatur-defekten Mutanten und welche Signalwege hierbei eine Rolle spielen? Wir beobachteten signifikante Bildung von Kern-Foci der DSB-Marker γH2AX und 53BP1 nach Behandlung mit ACNU. Die Kinetik der Foci-Bildung und Reparatur war für beide Marker ähnlich und unterstützte das Konzept, dass DSB durch die Prozessierung von ACNU-induzierten ICL erzeugt werden. Bei späteren Zeitpunkten nach der Behandlung nahmen die Foci-Levels in allen WT-Zellen signifikant ab, während in den HR-Mutanten signifikant erhöht blieben (was auf fehlende DSB-Reparatur hinweist). Die NHEJ-Mutanten, dagegen, zeigten eine gering gestörte DSB-Reparatur. 4) Gibt es eine Zellzyklusabhängigkeit bei der Entstehung von DSB? In synchronisierten Hamsterzellen konnten wir nachweisen, dass die Kern-Foci von DNA-Reparaturproteine, die zu den Stellen der DSB rekrutiert werden (γH2AX, ATMS1981, MDC1- und RPA2), sich erst in der S- Phase des Behandlungszyklus bilden und sich während dem G2-Phase-Block anhäufen. 5) Führt die chemische Inhibition von HR-Proteinen (HRi) in Glioblastom-Zellen zu deren Sensibilisierung gegenüber CNU? In kultivierten Glioblastom-Zellen bestätigten wir im Koloniebildung-Test die Sensibilisierung gegenüber CCNU (Lomustin) mit niedermolekularen Inhibitoren des RAD51-Proteins (RI-1, B02) oder MRE11- (Mirin). Die Sensibilisierung war auf die erhöhten Apoptoseraten zurückzuführen, wie im AV/PI-Test gezeigt. Die Aktivierung von Kaspasen und PARP1 bestätigte die Apoptoseinduktion. Die nach CCNU überlebenden Zellen wiesen Merkmale der Seneszenz auf, insbesondere nach HRi. Die ICL-Entstehung und Reparatur wurden im modifizierten Komet-Test mit bestrahlten Zellen demonstriert. Die Bildung und fehlende Reparatur von DSB nach CCNU und HRi wurden durch die Detektion von Kern-Foci der rekrutierten DSB-Marker bestätigt. Eine hemmende Wirkung von CCNU und HRi auf die DNA- Replikation konnte mit Hilfe der DNA-Faser-Technik und des EdU-Einbau-Tests in S-Phase Zellen nachgewiesen werden. Mittels der Methode von EU-Einbau während der RNA-Synthese untersuchten wir die Effekte von CCNU und HRi auf die Transkription, wobei eine eindämmende Wirkung von B02 und Mirin festgestellt wurde. Im subkutanen Xenograft-Modell mit U87MG- Gliomzellen zeigten wir, dass RI-1 signifikant die Tumorzelltoxizität von CCNU erhöht, sodass das Wachstum der subkutanen Tumoren in Nacktmäusen aufgehalten werden kann.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2018) HDAC1 and HDAC2 integrate checkpoint kinase phosphorylation and cell fate through the phosphatase-2A subunit PR130. Nature communications 9 (1) 764
Göder, Anja; Emmerich, Claudia; Nikolova, Teodora; Kiweler, Nicole; Schreiber, Maria; Kühl, Toni; Imhof, Diana; Christmann, Markus; Heinzel, Thorsten; Schneider, Günter; Krämer, Oliver H.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/s41467-018-03096-0) - (2011) Artesunate induces oxidative DNA damage, sustained DNA double-strand breaks, and the ATM/ATR damage response in cancer cells. Mol Cancer Ther 10(12):2224-33
Berdelle N, Nikolova T, Quiros S, Efferth T, Kaina B
- (2012) Chloroethylnitrosourea-induced cell death and genotoxicity: cell cycle dependence and the role of DNA double-strand breaks, HR and NHEJ. Cell Cycle 11(14):2606-2619
Nikolova T, Hennekes F, Bhatti A., Kaina B
(Siehe online unter https://doi.org/10.4161/cc.20862) - (2013) Human three prime exonuclease TREX1 is induced by genotoxic stress and involved in protection against UV light and anticancer drugs. Biochim Biophys Acta 1833 (8):1832-43
Tomicic M, Aasland, D, Kaina B, Nikolova T, Christmann M
- (2013) Survival and death strategies in glioma cells: autophagy, senescence and apoptosis triggered by a single type of temozolomide-induced DNA damage. PLoS One 8(1); e55665
Knizhnik A, Roos WP, Nikolova T, Quiros S, Tomazsowski K, Christmann M, Kitzinger R, Kaina B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055665) - (2013). Contribution of ATM and ATR to the Resistance of Glioblastoma and Malignant Melanoma Cells to the Methylating Anticancer Drug Temozolomide. Mol Cancer Ther 12(11): 2529-40
Eich, M, Roos WP, Nikolova T, Kaina B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-13-0136) - (2014) DNA breaks and chromosomal aberrations arise when replication meets base excision repair. J Cell Biol 206(1):29-43
Ensminger M, Iloff L, Ebel C, Nikolova T, Kaina B, Löbrich M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1083/jcb.201312078) - (2014) The γH2AX Assay for Genotoxic and Nongenotoxic Agents: Comparison of H2AX Phosphorylation with Cell Death Response. Toxicol Sci 140(1):103-17
Nikolova T, Dvorak M, Jung F, Adam I, Krämer E, Gerhold-Ay A, Kaina B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/toxsci/kfu066) - (2015) The catalytic topoisomerase II inhibitor dexrazoxane induces DNA breaks, ATF3 and the DNA damage response in cancer cells. Br J Pharmacol 172(9):2246-57
Deng S, Yan T, Nikolova T, Fuhrmann D, Nemecek A, Gödtel-Armbrust U, Kaina B, Wojnowski L
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/bph.13046) - (2016) DNA damage response curtails detrimental replication stress and chromosomal instability induced by the dietary carcinogen PhIP. Nucleic Acids Res 44(21):10259-10276
Mimmler M, Peter S, Kraus A, Stroh S, Nikolova T, Seiwert N, Hasselwander S, Neitzel C, Haub J, Monien B, Nicken P, Steinberg P, Shay J, Kaina B, Fahrer J
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/nar/gkw791) - (2016) DNA damage signaling instructs polyploid macrophage fate in granulomas. Cell 167, 1264–1280
Herrtwich L, Nanda I, Evangelou K, Nikolova T, Horn V, Sagar, Erny D, Stefanowski J, Rogell L, Klein C, Gharun K, Follo M, Kremer B, Seidl M, Münke N, Sanger J, Fliegauf M, Aschmann T, Pfeiffer D, Sarazzin S, Sieweke M, Wagner D, Dierks C, Haaf T, Ness T, Zaiss MM, Voll R, Deshmukh S, Prinz M, Goldmann T, Hölscher C, Hauser A, Lopez-Contreras AJ, Grün D, Gorgoulis V, Diefenbach A, Henneke P, Triantafyllopoulou A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.054) - (2016)Targeting homologous recombination by pharmacological inhibitors enhances the killing response of glioblastoma cells treated with alkylating drugs. Mol Cancer Ther 15(11): 2665-2678
Berte N, Piée-Staffa A, Piecha N, Wang M, Borgmann K, Kaina B, Nikolova T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-16-0176) - (2017) Chloroethylating nitrosoureas in cancer therapy: DNA damage, repair and cell death signaling. BBA Rev Cancer 1868(1): 29–39
Nikolova T, Roos WP, Krämer OH, Kaina B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2017.01.004) - (2017) DNA fiber spreading assay to test HDACi effects on DNA and its replication. In: HDAC/HAT Function Assessment and Inhibitor Development: Methods and Protocols. Oliver H. Krämer (ed). Methods Mol Biol 1510:103-113
Nikolova T, Göder A, Parplys A, Borgmann K
