Strukturelle und biochemische Untersuchung von Säugetier Timeless
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mit der im Rahmen dieses Projektes entstandenen Veröffentlichung über die Cryo-EM- Struktur und die biochemische Analyse des Maus Timeless-Tipin-RPA-Komplexes haben wir die erste 3D-Struktur des Säugetier-Timeless-Proteins und damit auch die erste 3D-Struktur eines Timeless-Proteins überhaupt publiziert. Zudem konnten wird durch die Analyse der DNA-Bindung des Timeless-Tipin- und des Timeless-Tipin-RPA Komplexes neue Einsichten in deren Abhängigkeit von der DNA-Länge sowie von der DNA- und RPA-Konformation gewinnen. Aktuelle Publikationen anderer Arbeitsgruppen legen nahe, dass es sich bei dem Säugetier Timeless-Protein um ein sehr interessantes „Multi-Tasking“-Protein handelt, das auch bei der funktionellen Verknüpfung der Inneren Uhr mit anderen essentiellen zellulären Prozessen wie der Zellzyklusregulation, DNA-Replikation und DNA-Reparatur eine bedeutende Rolle spielt. Die Funktionen von Timeless in der inneren Uhr werden wahrscheinlich durch dessen Bindung an Cryptochrom1 (CRY1) vermittelt. Interessanterweise moduliert CRY1 durch DNA-Schädigung aktivierte Checkpoint-Signalwege tagesperiodisch, möglicherweise über tageszeit-abhängige CRY1-TIM Interaktionen. Da der N-terminale TIM-Bereich sowohl mit Tipin wie auch mit CRY1 und der Checkpoint- Kinase Chk1 interagiert, könnten alternative Interaktionen von TIM mit Tipin, CRY1 oder Chk1 die vielfältigen und teilweise verknüpften Funktionen von TIM bei der DNA Replikation, DNA-Reparatur und inneren Uhr vermitteln. Im Oktober 2015 berichteten zwei Publikationen (Xie et al, 2015 und Young et al, 2015), dass der C-terminale TIM-Bereich mit PARP1 interagiert und die TIM-PARP1 Interaktion für die Rekrutierung von TIM an geschädigte DNA, also für eine Funktion von TIM in der DNA-Reparatur essentiell ist. Xie et al. beschreiben auch die Kristallstruktur eines unserem kristallisierenden Fragment ähnlichen C-terminalen Fragmentes von humanem TIM im Komplex mit PARP1. Dies zeigt, dass auch die strukturelle Analyse von TIM und seinen diversen Interaktionen ein international kompetitives und spannendes Forschungsfeld darstellt, in dem wir durch die Publikation unserer Arbeiten am TIM-Tipin-RPA-Komplex vorne mit dabei sein konnten. Inzwischen haben wir auch bei der strukturellen Analyse der Cryptochrome signifikante Fortschritte gemacht. Unsere im Rahmen dieses Projektes gewonnenen Erkenntnisse bzgl. der Isolation, biochemischen und strukturellen Analyse des Säugetier Timeless Proteins stellen eine sehr gute Grundlage für weitere Arbeiten an der Struktur-Funktions-Analyse des Säugetier-Timeless-Proteins und seiner Interaktionen im Kontext der zirkadianen Rhythmik, der DNA-Replikation und der Genomstabilität dar.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2014) Architecture and ssDNA interaction of the Timeless-Tipin-RPA complex. Nucleic Acids Res. 42, 12912-12927
Witosch, J., Wolf, E. and Mizuno, N.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/nar/gku960) - “Structural Characterization of the Timeless-Tipin-RPA Complex and its Interaction with ssDNA”, 2014, LMU München
Justine Witosch
