Semiautomatisiertes Kristallisations- und Imaging-System
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wurde für eine Vielzahl an Proteinkristallisations-Projekten der kristallographisch arbeitenden Gruppen des Lehrstuhls Biochemie an der Universität Bayreuth (AG Steegborn und bis Sommer 2013 AG Blankenfeldt) sowie von kooperierenden Gruppen und Gruppen des Lehrstuhls Biopolymere verwendet. Schwerpunkte lagen auf Proteinen zweier intrazellulärer Signaltransduktionssysteme von Säugern (cAMP-Signaltransduktion und Deacetylasen; AG Steegborn) sowie von Proteinen aus Phenazin-Biosynthese und unbekannter Funktion aus Pseudosomaden und anderen humanpathogenen Bakterien (AG Blankenfeldt). Beispiele für Kollaborationsprojekten, für die das System verwendet wurde, sind ein bakterielles cAMP-bindendes Protein und das Muschelbyssusprotein PTMP1. Bei den Signaltransduktions-Proteinen wurden (a) Proteindeacylasen der Sirtuin-Familie und (b) Adenylylzyklasen untersucht. Es wurden mit dem Gerät Kristallisationsbedingungen für Sirtuin-Komplexe mit Substraten, Analoga und Produkten erarbeitet, welche die Untersuchung von Details der Substratbindung, Katalyse und Interaktion mit pharmakologischen Inhibitoren ermöglichten. Die identifizierten Bindungsstellen und Inhibitionsmechanismen können nun zur Weiterentwicklung der Substanzen verwendet werden. Für die Adenylylzyklasen wurden mit dem System Kristallisationsbedingungen für humane lösliche Adenylatzyklase (sAC) Apoform identifiziert, sowie für Komplexe mit Liganden und weitere Proteine des cAMP-Siganlings. Dadurch konnte insbesondere die bisher unbekannte Struktur der katalytischen sAC-Domänen sowie ihrer Komplexe mit Substrat, Produkten und Regulatoren - physiologischer ebenso wie pharmakologischer - gelöst werden, um die Regulatoren des Enzyms zur verstehen. Für die Pseudomonaden-Projekten wurden mit Hilfe des Systems streuende Kristalle von EgtD (Ergothioneine-Methyltransferase), einer Domäne des Quorum-Sensing-Regulators PqsR erarbeitet, sowie die Kristallisation einer Antibiotikaresistenzen-vermittelnden beta-Lactamase aus Mycobacterium tuberculosis. Bei diesen und den weiteren Projekten ermöglichte das System ein effizientes Screening von verschiedenen Bedingungen und Proben (z.B. Ligandenkombinationen) bei überschaubarem Probenverbrauch und ermöglichte so die erfolgreiche Etablierung von Kristallisationsbedingungen für die nachfolgende Röntgenstrukturanalyse.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012) Crystallization and preliminary crystal structure analysis of the ligand-binding domain of PqsR (MvfR), the Pseudomonas quinolone signal (PQS) responsive quorum-sensing transcription factor of Pseudomonas aeruginosa. Acta Crystallogr Sect F 68, 1034-9
Xu N, Yu S, Moniot S, Weyand M, Blankenfeldt W
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(2013) Crystal structure analysis of human Sirt2 and its ADP-ribose complex. J. Struct. Biol. 182, 136-43
S. Moniot, M. Schutkowski, C. Steegborn
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(2013) Directed evolution of Mycobacterium tuberculosis p-lactamase reveals gatekeeper residue that regulates antibiotic resistance and catalytic efficiency. PLoS One 8, e73123
Feiler C, Fisher AC, Boock JT, Marrichi MJ, Wright L, Schmidpeter PA, Blankenfeldt W, Pavelka M, DeLisa MP
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(2013) Ex-527 inhibits Sirtuins by exploiting their unique NAD+-dependent deacetylation mechanism. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, E2772-81
M. Gertz, F. Fischer, G.T.T. Nguyen, M. Lakshminarasimhan, M. Schutkowski, M. Weyand, C. Steegborn
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(2013) Structures of human sirtuin 3 complexes with ADP-ribose and with carba-NAD+ and SRT1720: binding details and inhibition mechanism. Acta Cryst. D 69, 1423-32
G.T.T. Nguyen, S. Schaefer, M. Gertz, M. Weyand, C. Steegborn
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(2014) Crystal structures of human soluble adenylyl cyclase reveal mechanisms of catalysis and of its activation through bicarbonate. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 3727-32
S. Kleinboelting, A. Diaz, S. Moniot, J. van den Heuvel, M. Weyand, L.R. Levin, J. Buck, C. Steegborn
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(2014) Crystallization and preliminary X-ray analysis of the ergothioneine-biosynthetic methyltransferase EgtD. Acta Cryst. F 70, 676-80
Vit A, Misson L, Blankenfeldt W, Seebeck FP
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(2014) Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of proximal thread matrix protein 1 (PTMP1) from Mytilus galloprovincialis. Acta Crystallogr. Sect. F 70, 769-72
M.H. Suhre, T. Scheibel, C. Steegborn, M. Gertz
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(2014) Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a mammalian type 10 adenylyl cyclase. Acta Crystallogr. Sect. F 70, 467-9
S. Kleinboelting, J. van den Heuvel, C. Kambach, M. Weyand, M. Leipelt, C. Steegborn
