Semiautomatisiertes Kristallisations- und Imaging-System
Final Report Abstract
Das Gerät wurde für eine Vielzahl an Proteinkristallisations-Projekten der kristallographisch arbeitenden Gruppen des Lehrstuhls Biochemie an der Universität Bayreuth (AG Steegborn und bis Sommer 2013 AG Blankenfeldt) sowie von kooperierenden Gruppen und Gruppen des Lehrstuhls Biopolymere verwendet. Schwerpunkte lagen auf Proteinen zweier intrazellulärer Signaltransduktionssysteme von Säugern (cAMP-Signaltransduktion und Deacetylasen; AG Steegborn) sowie von Proteinen aus Phenazin-Biosynthese und unbekannter Funktion aus Pseudosomaden und anderen humanpathogenen Bakterien (AG Blankenfeldt). Beispiele für Kollaborationsprojekten, für die das System verwendet wurde, sind ein bakterielles cAMP-bindendes Protein und das Muschelbyssusprotein PTMP1. Bei den Signaltransduktions-Proteinen wurden (a) Proteindeacylasen der Sirtuin-Familie und (b) Adenylylzyklasen untersucht. Es wurden mit dem Gerät Kristallisationsbedingungen für Sirtuin-Komplexe mit Substraten, Analoga und Produkten erarbeitet, welche die Untersuchung von Details der Substratbindung, Katalyse und Interaktion mit pharmakologischen Inhibitoren ermöglichten. Die identifizierten Bindungsstellen und Inhibitionsmechanismen können nun zur Weiterentwicklung der Substanzen verwendet werden. Für die Adenylylzyklasen wurden mit dem System Kristallisationsbedingungen für humane lösliche Adenylatzyklase (sAC) Apoform identifiziert, sowie für Komplexe mit Liganden und weitere Proteine des cAMP-Siganlings. Dadurch konnte insbesondere die bisher unbekannte Struktur der katalytischen sAC-Domänen sowie ihrer Komplexe mit Substrat, Produkten und Regulatoren - physiologischer ebenso wie pharmakologischer - gelöst werden, um die Regulatoren des Enzyms zur verstehen. Für die Pseudomonaden-Projekten wurden mit Hilfe des Systems streuende Kristalle von EgtD (Ergothioneine-Methyltransferase), einer Domäne des Quorum-Sensing-Regulators PqsR erarbeitet, sowie die Kristallisation einer Antibiotikaresistenzen-vermittelnden beta-Lactamase aus Mycobacterium tuberculosis. Bei diesen und den weiteren Projekten ermöglichte das System ein effizientes Screening von verschiedenen Bedingungen und Proben (z.B. Ligandenkombinationen) bei überschaubarem Probenverbrauch und ermöglichte so die erfolgreiche Etablierung von Kristallisationsbedingungen für die nachfolgende Röntgenstrukturanalyse.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1107/S2053230X14004014)
