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Projekt
Leishmania major Promastigoten invasion vom Autophagy Kompartiments und Amastigoten ausbruch aus der Parasitären Vakuole
Antragsteller
Professor Dr. Paul Walther; Professor Dr. Ger van Zandbergen
Fachliche Zuordnung
Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
Förderung
Förderung von 2011 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 197967827
Zum besseren Verständnis von Infektion und Verlauf der wollen wir infektiöse Promastigoten-Stadien und Amastigoten in humanen Makrophagen untersuchen. Während der ersten dreijährigen Förderperiode hat die Gruppe Zandbergen ein neues Labor am Paul Ehrlich Insitut aufgebaut. Mit zusätzlichen Drittmitteln wurde ein Zeiss Live 7 konfokales Hochgeschwindigkeits-Lichtmikroskop und ein Wohlwend Hochdruck-Gefrierer zur Präparation für die Elektronenmikroskopie angeschafft. (i) Wir haben die L. major enthaltenden parasitophoren Vakuolen in humanen Makrophagen mit neuen elektronenmikroskopischen Verfahren untersucht (Hochdruck-Einfrieren und Elektronen-Tomographie). Speziell interessiert waren wir dabei an den Interaktionen der Promastigoten mit der autophagen Vakuole und dem Ausbruch der Amastigoten aus der parasitophoren Vakuole. (ii) Wir haben in primären humanen Makrophagen Autophagie und lysosomale Reifung heruntergeregelt. (iii) Wir haben eine neue Methode etabliert zur Exprimierung von EGFP-LC3 und LAMP2-mCherry mit lentiviraler Transduktion von primären humanen Zellen für die dynamische Lichtmikroskopie. Damit untersuchten wir LC3 und Leishmania-Strukturen. Wir haben außerdem unser Protokoll zur Hochdruck-Kryofixation weiterentwickelt und verwenden nun Objektträger aus Saphir mit Koordinatensystem, die optimal für korrelative Licht- und Elektronen-Tomographie geeignet sind. In der zweiten dreijährigen Förderperiode wollen wir (i) die molekularen Grundlagen aufschlüsseln, die den Eintritt der Promastigoten in den Autophagie-Stoffwechsel und den Ausbruch der Amastigoten ins Zytoplasma steuern, (ii) die elektronenmikroskopische Präparation basierend auf Hochdruckeinfrieren für die 3D Elektronenmikroskopie weiterentwickeln und verbessern. Dazu werden wir Leishmania-infizierte, mit LC3 und/oder LAMP2 transduzierte Makrophagen mit TEM Serienschnitten und mit FIB-SEM Tomographie untersuchen. Diese ultrastrukturellen Daten werden wir mit der Verteilung der Kompartiment-Proteine korrelieren, die wir mit Hilfe der konfokalen Lichtmikroskopie in denselben Zellen finden. (iii) Um unser Verständnis des Verlaufs der Leishmania-Infektion zu verbessern, werden wir die oben beschriebenen Techniken auf neue Zielproteine anwenden, die wir aus einem Massenspektrometrie-Screen aus isolierten Leishmania-Kompartimenten erhalten.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
