Mechanismus, Protonen-Kotransport und Direktionalität der Formiat-Nitrit-Transporterfamilie (FNT)

• Antragsteller: Professor Dr. Eric Beitz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Pharmazie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 200682196

Schwerpunkt der ersten Projektphase war die zellfreie Produktion und Charakterisierung problematischer Membranproteine. Dabei führten unsere Untersuchungen zum putativen Formiat-Nitrit-Transporter (PfFNT) aus Malaria-Parasiten zu einem unerwarteten Durchbruch im Malaria-Forschungsfeld. PfFNT hat sich als derzeit wichtigster Kandidat für den lange gesuchten Laktat-Transporter der Parasiten erwiesen und stellt ein viel versprechendes neues Wirkstoffziel dar. Das Arbeitsprogramm des vorliegenden Antrags wurde an die Gutachtervorschläge angepasst, d.h. Herausnahme der unsicheren Proteinkristallisation und Verlagerung des Schwerpunkts auf Untersuchungen zu den grundlegenden, weitgehend ungeklärten Mechanismen der Formiat-Nitrit-Transporterfamilie bezüglich Anionentransport, Protonen-Kotransport und Direktionalität.Wir werden zwei neue FNT-Proteine aus Bacillus thuringiensis (BtFNT) und Entamoeba histolytica (EhFNT) klonieren und erstmals im Vergleich zu den etablierten bakteriellen und plasmodialen FNTs eingehend biochemisch charakterisieren. Diese Auswahl hat zwei Gründe: 1. B. thuringiensis ist sehr nah verwandt mit äußerst pathogenen Bacillus-Arten, wie dem Milzbranderreger und E. histolytica selbst ist der Erreger der Amöbenruhr, dessen FNT den bislang unbekannten Transporter des metabolischen Endprodukts Acetat darstellen könnte. Beide FNTs sind somit therapeutisch interessant. 2. BtFNT und EhFNT weisen einen Austausch eines hoch konservierten Histidins im Transportkanal zu Glutamin bzw. Asparagin auf. Das Histidin ist zentral für die derzeitigen Modelle zum Transportmechanismus der FNT-Familie, die eine Protonierung des passierenden Anions durch ein Protonen-Relais bestehend aus dem erwähnten Histidin plus ein ebenso konserviertes Threonin und ein fixiertes Wassermolekül postulieren. Die Säureamide Glutamin und Asparagin fungieren aber nicht als Protonenakzeptor bzw. -donator. Offensichtlich hat die Natur hier Variationen zugelassen, die wir ausnutzen wollen, um detaillierte Aussagen zum Protonierungsmechanismus der FNTs, dem Protonen-Kotransport und der Direktionalität zu erhalten. Wir werden hierzu Mutanten in den kritischen Histidin- und Threonin-Positionen herstellen, Assaysysteme auf Hefebasis sowie mit Proteoliposomen nutzen und neu etablieren, Protonen-Kotransport durch Fluroszenzindikatoren direkt visualisieren und Membransysteme generieren, in denen die Orientierung der FNT-Proteine gleichgerichtet ist bzw. wir eine Transportrichtung selektiv hemmen, um Direktionalität zu analysieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen