Mechanismus, Protonen-Kotransport und Direktionalität der Formiat-Nitrit-Transporterfamilie (FNT)
Pharmazie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Projekt konnten wir sämtliche Ziele zur Aufklärung des Mechanismus, des Protonen-Kotransports und der Direktionalität der Formiat-Nitrit-Transporterfamilie (FNT) erreichen. Unsere experimentellen Daten mit neuen, erstmals charakterisierten FNT aus Bacillus- und Amoeba-Arten schlossen nicht nur den in der Literatur postulierten Transportmechanismus über eine Protonenübertragungskaskade („proton relay“) um ein zentral im Transportpfad lokalisiertes Histidins aus, sondern ließ uns die Poreneintrittsbereiche mit noch stärker als das Histidin konservierten Lysinen als die entscheidenden Regionen identifizieren. Mit zahlreichen, aussagekräftigen biophysikalischen Analysen zeigten wir, dass die anionische Form der Substrate, beispielsweise Laktat, durch die positive Ladung des Lysins in die zunehmend hydrophobere Porenumgebung angezogen wird. Dadurch erfährt das Substrat eine Abschwächung seiner Säurestärke und es kommt zur Protonierung durch das Bulkwasser. Wir nennen diesen neuen, alternativen Mechanismus „dielectric slide“. Der symmetrische Aufbau der FNT ermöglicht diesen Mechanismus in beide Transportrichtungen gleichermaßen. Dies konnten wir bei vergleichenden Transportassays im Hefe-Zellsystem und in Proteoliposomen, die jeweils eine umgekehrte Orientierung der Transporter in der Membran aufweisen, zeigen. Basierend auf unseren Daten (starre, kanalartige Proteinstruktur aber sekundärtransporttypische Abhängigkeit vom Protonengradienten) schlagen wir die Einführung einer neuen Klasse von Transportern für schwache Säure und Basen vor, die zwischen den Kanälen und Sekundärtransportern liegt. Der uns durch das Projekt zur Verfügung stehende erweiterte Satz an FNT Proteinen und Sequenzinformationen ermöglichte es uns, zusätzlich zum Arbeitsprogramm einen molekularen Filterbereich im Transportpfad der FNT zu identifizieren. Dieser Filter selektiert die Substrate nach dem Größenausschlussprinzip, ist der Positionierung und Zusammensetzung nach ähnlich zum Selektivitätsfilter der Aquaporin Wasser-/Solutkanäle und lässt allein durch Sequenzanalyse in neuen FNT sehr sicher auf deren Substrat-Spektrum schließen, was direkte Rückschlüsse auf die physiologische Funktion gestattet. Darüber hinaus ermöglichte uns der im Projekt verwendete Transportassay eine Substanzbibliothek mit 400 Antimalaria-Wirkstoffen mit unbekanntem Wirkstoffziel zu screenen und eine neue Substanzklasse mit neuem Wirkprinzip, nämlich der FNT-Hemmung, zu etablieren. Diese Verbindungen haben wir patentgeschützt und wir verfolgen deren Entwicklung in Richtung neuer Therapieoptionen gegen die Malaria weiter. Ebenso könnte sich das im Projekt erstmals untersuchte FNT aus Entamoeba histolytica als neues geeignetes Wirkstoffziel gegen die Amöbenruhr erweisen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2016) High-level cellfree production of the malarial lactate transporter PfFNT as a basis for crystallization trials and directional transport studies. Protein Expr. Purif. 126: 109-114
Holm-Bertelsen, J., Bock, S., Helmstetter, F., Beitz, E.
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(2017) A widened substrate selectivity filter of eukaryotic formate-nitrite transporters enables high-level lactate conductance. FEBS J. 284: 2663-2673
Wiechert, M., Erler, H., Golldack, A., Beitz, E.
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(2017) Formate-nitrite transporters: monoacids ride the dielectric slide. Channels 11: 365-367
Wiechert, M., Beitz, E.
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(2017) Mechanism of formate-nitrite transporters by dielectric shift of substrate acidity. EMBO J. 36: 949-958
Wiechert, M., Beitz, E.
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(2017) Substrate-analogous inhibitors exert antimalarial action by targeting the Plasmodium lactate transporter PfFNT at nanomolar scale. PLoS Pathog. 13: e1006172
Golldack, A., Henke, B., Bergmann, B., Wiechert, M., Erler, H., Blancke Soares, A., Spielmann, T., Beitz, E.
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(2019) Formatenitrite transporters carrying nonprotonatable amide amino acids instead of a central histidine maintain pH-dependent transport. J. Biol. Chem. 294: 623-631
Helmstetter, F., Arnold, P., Höger, B., Petersen, L.M., Beitz, E.
