Enzymsubstitutionstherapien bei Molybdän-Cofaktor-Defizienz
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In den hier durchgeführten Studien konnte erfolgreich ein Mausmodell (knockout des gesamten murinen Mocs2-Gens = Mocs2-/- Mäuse) für die Molybdän-Cofaktor-Defizienz (MOCOD) Typ B generiert werden. Um mögliche Anhaltspunkte auf einen gewebespezifischen Phänotyp der Mocs2-/- Mäuse zu erhalten, wurden zunächst Untersuchungen zur Expression der Mocs2a/b Isoformen in verschiedenen Geweben der Maus durchgeführt. Diese Expressionsanalysen der Mocs2a/b Isoformen auf RNA- und Proteinebene in verschiedenen Geweben von Wildtyp Mäusen zeigten, dass Mocs2a/b ubiquitär exprimiert wird und dass die höchsten Expressionslevel von Mocs2a/b in der Haut, der Leber, im Gehirn, der Lunge und der Niere detektiert werden konnten. Weiterhin konnte mit Hilfe des LacZ-Gens im knock out Konstrukt von heterozygoten Mocs2 knock out Mäusen und nachfolgender LacZ-Färbung an verschiedenen Gewebeschnitten eine spezifische β-Galactosidase Expression (= indirekte Mocs2a/b Expression) auf zellulärer Ebene aufgezeigt werden. So konnten LacZ-positive Zellen in neuronalen Zellen des Gehirns, in Zellen des Sammelkanalsystems der Niere, in Zellen der Leber, in Spermatogonien des Testis, in Ooozyten des Ovars und in Haarfollikel-Zellen der Haut nachgewiesen werden. Die prominenteste LacZ-Färbung fand sich dabei in Zellen neuronalen Ursprungs im Gehirn von adulten Mocs2+/- Mäusen, hier konnte eine intensive und spezifische LacZ-Färbung in Neuronen im Bereich des Hippocampus, des Cortex und des Gehirnstamms detektiert werden. Dieses o.g. Expressionsmuster im Gehirn konnte ebenfalls mit Hilfe eines Mocs2aspezifischen Antikörpers nachgewiesen werden. Phänotypische Analysen zeigten, dass Mocs2-/- Mäuse in Übereinstimmung mit den Mendelschen Regeln geboren wurden und bei Geburt unauffällig erschienen. Jedoch konnte bereits einige Stunden nach der Geburt eine signifikante Abnahme des Körpergewichts bei Mocs2-/- Mäusen im Vergleich zu Mocs2+/-- und Mocs2+/+-Geschwistern beobachtet werden. Weiterhin wurde im weiteren Verlauf postnatal eine verlangsamte Zunahme des Körpergewichts bei den Mocs2-/- Mäusen im Vergleich zu den Mocs2+/-- und Mocs2+/+-Geschwistern gemessen. Zusätzlich zeigten Mocs2-/- Mäuse Auffälligkeiten der Haut, einen Defekt des gesamten Haarwachstums und eine allgemein geschwächte postnatale Physis im Vergleich zu ihren Mocs2+/-- und Mocs2+/+- Geschwistern. Mocs2-/- Mäuse verstarben innerhalb der ersten 12 Tage nach Geburt mit einer mittleren Überlebensrate von 4,7 Tagen. Durch histopathologische Analysen des Gehirns von Mocs2-/- - und Mocs2+/- Mäusen konnte eine erhöhte Apoptoserate neuronaler Zellen im Bereich des Hippocampus, des Cortex und des Gehirnstamms im Vergleich zu den Mocs2+/+ Geschwistermäusen detektiert werden. Mit Hilfe des Ansatzes transgener Mäuse konnte kein singuläres knockout Mausmodell für die Mocs2b Isoform generiert werden, vermutlich aufgrund des Integrationsorts des MOCS2A Transgens im Dnajc24-Gen. Dahingegen konnte erfolgreich ein singuläres knockout Mausmodell für die Mocs2a Isoform mit Hilfe einer transgenen Mauslinie für MOCS2B etabliert werden. Die Mäuse mit einem singulären knock out der Mocs2a Isoform zeigten einen ähnlichen Phänotyp wie Mocs2-/- Mäuse. Es konnte zwar kein kompletter Rescue des Phänotyps von Mocs2-/- Mäusen erzielt werden, jedoch wurde eine signifikant verbesserte postnatale Gewichtszunahme sowie eine Tendenz der Erhöhung der mittleren Lebenserwartung nachgewiesen. Parallel zum o.g. Rescue Experiment von Mocs2-/- Mäusen mittels transgener Mäuse, wurde ein präklinischer Gentherapie-Ansatz mit Hilfe rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) entwickelt, die entweder das humane MOCS2B Protein oder ein MOCS2B-EGFP Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors exprimieren. Die rAAVs mit dem MOCS2B-EGFP Fusionsprotein wurden mittels intrahepatischer Injektion postnatal appliziert, ca. 2-7% der Leberzellen konnten so erfolgreich transduziert werden und eine Expression dieses Fusionsproteins konnte noch für mindestens zwei Jahre nach singulärer Injektion in der Leber von behandelten Mäusen detektiert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Experimenten mit den transgenen MOCS2B Mäusen, konnten intrahepatische Injektionen von Mocs2-/- Mäusen mit rAAVs und MOCS2B Expression keinen kompletten Rescue des Phänotyps von Mocs2-/- Mäusen erreichen, jedoch wurde auch hier eine verbesserte postnatale Gewichtszunahme sowie eine Erhöhung der mittleren Lebenserwartung in behandelten Mäusen beobachtet. In einem weiteren Teilabschnitt der hier durchgeführten Arbeiten wurden Langzeitexperimente durchgeführt, um das maligne Potential eines rAAV-basierten Gentherapie-Ansatzes in vivo zu überprüfen. Hierbei konnte demonstriert werden, dass das Auftreten von Tumoren nach intrahepatischer Injektion von rAAVs, im Speziellen das Auftreten hepatozellulärer Karzinome, Mausstamm-spezifisch erfolgt, d.h. das hepatozelluläre Karzinome häufiger in rAAV behandelten Tieren des Mausstammes C57Bl/6N nachgewiesen wurden als in Tieren des Mausstammes 129sv. Weiterhin konnte mit Hilfe dieses Langzeitexperiments gezeigt werden, dass eine intrahepatische Injektion von rAAVs nur in Tieren des Mausstammes C57Bl/6N eine erhöhte Inzidenz von hepatozellulären Karzinomen im Vergleich zu den kontrollbehandelten Tieren verursacht.
