Screeningplattform für das Protein-Engineering
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Fördermittel der DFG und des Bundeslandes Mecklenburg-Vorpommern ermöglichten es uns, eine vollautomatisierte Roboter-unterstützte Screeningplattform zu beschaffen, die das Auffinden gewünschter optimierter Enzyme unter standardisierten und sehr reproduzierbaren Bedingungen mit hohem Durchsatz signifikant erleichtert. Der wesentliche Vorteil besteht in der Integration sämtlicher üblicherweise manuell von einem Wissenschaftler im Labor ausgeführten Einzelschritte: Kultivierung der Mikroorganismen/Klone im Mikrotiterplattenformat, anschließende Induktion der Genexpression zur Biosynthese des Zielproteins, Zentrifugation der Platten, Zellaufschluss, Entnahme von Zelllysat. Anschließend werden diese Lysate ggf. Verdünnungsschritten unterworfen, gefolgt von der Bestimmung des Proteingehalts (z.B. via BCA-Assay) und der gesuchten Enzymaktivität. Die Roboter-Plattform erlaubt es all diese Teilschritte automatisiert ablaufen zu lassen. Durch eine adäquate Dokumentation (via Barcode-Reader zur Nachverfolgung aller Schritte über die Software) ist eine detaillierte Ablaufplanung bzw. Simulation aller notwendigen Schritte, eine einfache Wiederholung häufiger Prozeduren und somit die Möglichkeit einen wesentlich höheren Durchsatz zu erreichen, etabliert worden. Diese Plattform wurde bereits umfangreich und sehr erfolgreich für diverse Enzymklassen und deren Protein-Engineering eingesetzt, beispielsweise für Transaminasen, Baeyer-Villiger Monoxygenasen, Lipasen, Esterasen, Acylasen und Haloalkan-Dehalogenasen, wobei Fragestellungen wie Substratspektrum, Selektivität und Stabilität (Temperatur, Lösungsmittel) im Vordergrund standen. Die wissenschaftliche Bedeutung dieser mittels der Roboter-Plattform entwickelten Methoden sei dadurch angezeigt, dass eine Veröffentlichung in "Biotechnology & Bioengineering" von dieser Zeitschrift als sogenanntes "Spotlight" mit verlinktem Video beworben wurde.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2015), Alteration of the donor/acceptor spectrum of the (S)-amine transaminase from Vibrio fluvialis, Int. J. Mol. Sci., 6, 26953-26963
Genz, M., Vickers, C., van den Bergh, T., Joosten, H.J., Dörr, M., Höhne, M., Bornscheuer, U.T.
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(2015), In-depth highthroughput screening of protein engineering libraries by split-GFP direct crude cell extract data normalization, Chem. Biol., 22, 1406-1414
Santos-Aberturas, J., Dörr, M., Waldo, G.S., Bornscheuer, U.T.
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(2016), Engineering the amine transaminase from Vibrio fluvialis towards branched-chain substrates, ChemCatChem, 8, 3199-3202
Genz, M., Melse, O., Schmidt, S., Vickers, C., Dörr, M., van den Bergh, T., Joosten, H.J., Bornscheuer, U.T.
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(2016), Fully automatized high-throughput enzyme library screening using a robotic platform, Biotechnol. Bioeng. 113, 1421-1432
Dörr, M., Fibinger, M.P.C., Last, D., Schmidt, S., Santos-Aberturas, J., Vickers, C., Voss, M., Bornscheuer, U.T.
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(2016), Multimeric racemases identified via bioinformatic analysis of fold type III PLP- dependent enzymes, Appl. Microbiol. Biotechnol.
Knight, A.M., Nobili, A., van den Bergh, T., Genz, M., Joosten, H.J., Albrecht, D., Riedel, K., Pavlidis, I.V., Bornscheuer, U.T.
