Automationsanlage für pro- und eukaryontisches Arbeiten inklusive Analytik
Mikrobiologie, Virologie und Immunologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die robotische Anlage wurde zunächst für ein großes Projekt eingeplant, in dem der Basalpromoter von Drosophila sowohl mit funktional-genomischen wie auch synthetischen Ansätzen untersucht wird. Die funktional-genomischen Untersuchungen umfassten eine bioinformatische Analyse auf Promotermotive und Sequenzkontext, Bindung von Nukleosomen mittels MNase, Bindung von generellen Transkriptionsfaktoren durch CRISPR und ChIP-seq, sowie die Analyse von naszenten Transkripten durch DTA. Auf dieser Grundlage wurde eine HMM Analyse durchgeführt, die zu einer verbesserten Klassifizierung aller genomischen Promotoren geführt hat. Auf dieser Grundlage erfolgte dann das Design synthetischer Promotoren, in denen Nukleosomenokkupanz (-1, 0, +1), Promotermotive, deren Position und Sequenzkontext systematisch modifiziert wurden. Um schließlich Modelle für die Transkription entwickeln zu können, müssen 10,000 synthetische Promotoren analysiert werden. Die robotische Anlage erlaubte uns, diese Promotoren mittels BsaI zu klonieren, Kolonien zu picken, Minipreps herzustellen, deren DNA Konzentration zu vermessen und die Konstrukte über Illumina Sequenzierung zu validieren. Die synthetischen Promotoren werden in einem Dual Luciferase Assay (DLA) auf ihre Aktivität geprüft. Die robotische Anlage erlaubt, im Hochdurchsatz S2 Zellen zu transfizieren und den DLA durchzuführen. Für die gesamte experimentelle Pipeline mussten neue Protokolle entwickelt werden, die hohe technische und biologische Reproduzierbarkeit (CV<10%) garantieren; auch die Datenspeicherung und –analyse sind ein wichtiger Bestandteil der Robotik. Ohne Robotik hätte dieses Projekt nicht umgesetzt werden können.
