Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Aktivierung von Granulozyten durch Antikörper gegen das Humane-Neutrophilen-Antigen 3a
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt haben wir zuerst stabile Zelllinien etabliert, welche HNA-3b bzw. HNA-3a in zwei CTL2-Transkriptionsvarianten exprimieren. Hierüber können wir humane anti-HNA-3-Antikörper aufreinigen. Zum Mechanismus der HNA-3a-AK-induzierten Neutrophilenaggregation haben wir mit Protease-Inhibitoren gezeigt, dass dieser nicht von Faktoren des Blutplasmas, jedoch von einer intrinsischen Serin-Protease mit Trypsin- bzw. Chymotrypsinaktivität abhängt. Die gleichen Protease- Inhibitoren hemmen die Granulozyten-Aktivierung sowohl durch HNA-3a- als auch HNA-2- Antikörper (Cathepsin G, Proteinase 3 und Neutrophilen Elastase wurden sicher als verantwortliche Proteinasen ausgeschlossen). Dies weist darauf hin, dass die beteiligte(n) Protease(n) auch an anderen Formen der akuten Lungeninsuffizienz beteiligt sein könnten. Desweiteren konnten wir zeigen, dass die Fähigkeit zur HNA-3a-AK vermittelten Neutrophilenaggregation durch die gezielte Voraktivierung der Zellen verstärkt wird und liefern damit einen ersten Beweis der „Threshold- Hypothese“, nach der die Schwere der induzierten TRALI von Risikofaktoren im Patienten während der Transfusion abhängt, und eine Erklärung, warum das gleiche Plasma bei unterschiedlichen HNA- 3a homozygoten Patienten ganz unterschiedlich schwere TRALI-Verläufe induziert. HNA-3a-Antikörper induzieren keinen direkten oxidativen burst (ROS-Produktion) in Granulozyten, und keine erhöhte Expression von CD11b und damit keine verstärkte Degranulation. Eine signifikant verstärkte Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase ERK1/2 wurde ebenfalls nicht beobachtet. Diese Ergebnisse waren unerwartet, da die Schädigung des Lungenendothels im Pathogenesemodell der TRALI den destruktiven Effektoren aktivierter Neutrophiler zugeschrieben wurde. Im Folgenden haben wir andere Möglichkeiten untersucht, wie HNA-3a-AK TRALI induzieren. Zuerst haben wir gezeigt, dass HNA-3a-AK zur Aktivierung von Mac-1 (CD11b/CD18) durch Konformationsänderung führen. Durch die Nutzung der Rasterkraftmikroskopie konnten wir dann zeigen, dass HNA-3a-AK zur aktinvermittelten Versteifung von Neutrophilen führen. Massenspektrometrische Analysen deuten darauf hin, dass hierbei RhoGTPase-regulierende Proteine beteiligt sind. Damit führen HNA-3a-AK durch Aktivierung von CD11b und durch eine Versteifung der Zellen vor allem zu einer verstärkten Ansammlung von Neutrophilen vor engen Kapillaren im Gefäßsystem der Lunge. Parallel zu unseren Arbeiten wurden Ergebnisse einer kooperierenden Gruppe veröffentlicht, die zeigen, dass CTL2 auf Endothelzellen exprimiert wird und HNA-3a-AK deren Aktivierung und die Störung der Barrierefunktion auslösen. Unter Berücksichtigung aller Resultate lässt sich folgendes Pathogenesemodell der HNA-3a-induzierten TRALI entwerfen: Die Transfusion von HNA-3a-AK induziert die Versteifung von neutrophilen Granulozyten und verursacht die Aktivierung von Mac-1 auf deren Oberfläche. Diese akkumulieren aufgrund ihrer Rigidität vor den Lungenkapillaren. Parallel aktivieren die HNA-3a-AK das Lungenendothel und verstärken eine direkte Bindung adhäsiver Neutrophiler. Das aktivierte Endothel sezerniert proinflammatorische Mediatoren und aktiviert hierüber indirekt die angesammelten Neutrophilen. Diese verursachen nun die Störung des Endothels. Schließlich führt der Austritt der Gefäßflüssigkeit zur Entstehung des Lungenödems. Die im Förderungszeitraum erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen grundlegende Aspekte der Wirkung von HNA-3a-AK auf neutrophile Granulozyten. Sie beweisen das „Threshold-Model“ der immunogenen TRALI und haben zu einem neuen Modell der Pathogenese von TRALI durch HNA-3a Antikörper geführt. Weitreichende Perspektiven für die pharmakologische Prävention Granulozytenverursachter Lungenschädigungen ergeben sich aus unserem Ergebnis, dass Inhibitoren (z.B. TLCK und TPCK) von Serin-Proteasen mit Trypsin- bzw. Chymotrypsinaktivität die HNA-3a-Antikörperinduzierten Veränderungen von Granulozyten hemmen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Expression of the CTL2 transcript variants in human peripheral blood cells and human tissues. Transfusion. 2013; 53(12):3217–3223
Flesch BK, Wesche J, Berthold T, et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/trf.12160) - Human neutrophil antigen-3a antibodies induce neutrophil aggregation in a plasma-free medium. Blood transfusion = Transfusione del sangue. 2013;1–7
Schubert N, Berthold T, Muschter S, Wesche J, Fürll B, Reil A, Bux J, Bakchoul T und Greinacher A
(Siehe online unter https://doi.org/10.2450/2013.0294-12) - Impact of priming on the response of neutrophils to human neutrophil alloantigen-3a antibodies. Transfusion. 2014 [Epub ahead of print]
Berthold T, Muschter S, Schubert N, Wesche J, Ameling S, Teumer A, Reil A, Bux J, Bakchoul T und Greinacher A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/trf.12898) - HNA antibody-mediated neutrophil aggregation is dependent on serine protease activity. Vox Sang Vol 109 Issue 104, November 2015, Pages 366-374
Berthold T, Schubert N, Muschter S, Rohr M, Wesche J, Reil A, Bux J, Bakchoul T und Greinacher A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/vox.12292) - Human neutrophil antigen‐3a antibodies induce neutrophil stiffening and conformational activation of CD11b without shedding of L‐selectin. Transfusion Vol 55 Issue 12, December 2015, Pages 2939-2948
Berthold T, Glaubitz M, Muschter S, Gross S, Palankar R, Reil A, Helm C.A, Bakchoul T, Schwertz H, Bux J, Greinacher A and Delcea M
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/trf.13299)
