Strukturelle Basis kanonischer und nicht-kanonischer Translationstermination und Ribosomenrecycling durch eRF1/eRF3 und ABCE1

• Antragsteller: Professor Dr. Roland Beckmann
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2012 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 207100805

Im Projekt P3 (Beckmann) werden zwei essentielle Phasen der eukaryotischen Translation, nämlich Termination und Ribosomen-Recycling im humanen System und in Hefen (S. cerevisae) untersucht. In der ersten Förderperiode konnten funktionale Terminationkomplexe (mit eRF1 und eRF3) und Prä-Recycling-Komplexe (mit eRF1 und ABCE1) aus einem Weizenkeim-Translationsextrakt hergestellt werden. Um ein Stop-Codon in der ribosomalen A-Stelle zu positionieren, wurde ein virales Polypeptid mit einer Stalling-Sequenz verwendet. Die auf diese Weise angehaltenen Ribosomen wurden in vitro mit gereinigten Terminations/Recycling-Faktoren rekonstituiert und es wurden Kryo-EM-Strukturen der assemblierten Komplexe bei einer Auflösung von 8 bis 9 Å gelöst. Wir fanden heraus, dass sich die zentrale Domäne von eRF1 nach der Dekodierung des Stop-Codons (im Prä-Terminations-Komplex mit eRF3) in das Peptidyltransferase-Zentrum in der großen 60S-Untereinheit bewegt (im Komplex mit ABCE1), was zum Release der naszierenden Polypeptidekette führt. Dies erklärt auf einer strukturellen Ebene, wie eRF1 zugleich während der Termination und beim Ribosomen-Recycling seine Funktion erfüllt. Um gleichartige Strukturen vom humanen System zu erhalten wurde ein zuverlässiges und hocheffizientes humanes in vitro-Translationssystem etabliert. Um die Expression von Konstrukten für gestallte Ribosomen zu optimieren, wurden das Cricket Paralysis Virus (CrPV)-IRES verwendet, was den Vorteil hat, dass die Translations-Initiation unabhängig von Initiationsfaktoren ist. Auf dieser Basis konnten Terminations- und Prä-Recycling-Komplexe in vitro rekonstituiert und erste vielversprechende Kryo-EM-Rekonstruktionen gelöst werden. In der zweiten Förderperiode werden wir damit fortfahren, die molekulare Basis von Termination und Recycling mit Hilfe von Kryo-EM bei höchster Auflösung, welche durch die neulich aufgesetzte Technologie zur direkten Elektronendetektion (FEI Falcon 2) gewährleistet wird, aufzuklären. Der Focus soll hierbei auf den Mechanismen der eRF1-abhängigen Stop-Codon-Erkennung und Peptidyl-tRNA-Hydrolyse liegen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1805: Einfluss der Ribosomendynamik auf Regulation der Geschwindigkeit und Genauigkeit der Translation