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Projekt
Aufklärung der Mechanismen der unnatürlichen Proteintranslation mit erweitertem genetischen Code und orthogonalen Translationspaaren
Antragsteller
Professor Dr. Nediljko Budisa; Dr. Andrea C. Vaiana
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Förderung
Förderung von 2012 bis 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 207100805
In unserer bisherigen Arbeiten haben wir chemisch unterschiedliche Prolinanaloga (unter in vivo-Expressionsbedingungen) eingesetzt, um die Translation einzelner Proline und Oligoprolin-Abschnitte in verschiedenen Zielsequenzen systematisch zu untersuchen. Dabei haben wir entdeckt, dass Oligoprolin-Abschnitte unter Verwendung verschiedenen Analoga unterschiedlich vom Ribosom synthetisiert werden. In Zusammenarbeit mit P4 und P6 haben wir diese Analoga verwendet, um die Funktionsweise von Elongationsfaktor P (EF-P) in der Translation von Oligoprolin-Abschnitten zu verstehen. Der Einsatz einer Reihe von Deskriptoren (z. B. Seitenketten-Struktur, induktive Effekte, pKs) hat es uns ermöglicht, Prolin-Puckering als dominierenden Faktor für die beobachteten Variationen zu identifizieren. Wichtigster Fortschrit bei der Charakterisierung der Translation mit orthogonalen Paaren ist die Entdeckung, dass die häufig beobachtete Ineffizienz nicht ausschließlich von der Konkurrenz zwischen der orthogonalen tRNA und Freisetzungsfaktoren (RF), sondern aufgrund von ribosomalen stalling verursacht wird.Basierend auf diesen Ergebnissen sollte im nächsten Schritt der EF-P-Mechanismus bei der Proteinsynthese vollständig aufgeklärt werden. Experimentalen Arbeiten werden hierfür mit molekulardynamischen Simulationen verbunden. Zunächst werden chemische Peptidmodelle für die Amidbindungsbildung mit verschiedenen Analogen erzeugt um die Bildungsraten der Peptidbindung mit ribosomalen Raten zu vergleichen. Außerdem werden umfangreiche Moleküldynamiksimulationen (im Mikrosekunden-Bereich) des Ribosom-EF-P-Komplexes ausgeführt werden, um aufzuklären, wie EF-P ribosomales stalling an Oligoprolin-Abschnitten auflöst.Um die Rolle von stalling in der Translation mit orthogonalen Paaren vollständig zu verstehen, werden frühere Untersuchungen in Zusammenarbeit mit P6 (Parameterisierung) und P7 (profiling) fortgesetzt. Wir planen, die Positionen der betroffenen Ribosomen im zellulären mRNA-Pool in Gegenwart oder in Abwesenheit von RF-1 zu lokalisieren. Die weitere Charakterisierung der Effizienz von orthogonalen Paaren wird über Reportergenaktivität und Quantifizierungs-Assays in Gegenwart von einer unterschiedlichen Anzahl von in-frame amber stop-Codons durchgeführt werden. Darüber hinaus werden Pyrrolysin (Pyl) basierte orthogonale Paare (PylRS:tRNAPyl) verwendet werden, um die Rolle der ß-lysyl-Lysin-Modifikation an Position 34 in EF-P aufzuklären.Optimierte orthogonale Translation, insbesondere zum Einbau von crosslinking-Analoga, stellt ein effizientes Werkzeug für die Analyse von kotranslationaler Faltung und Strukturstudien dar.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
