Laborautomationsplattform
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Laborautomationsanlage wurde für zwei Anwendungsbereiche genutzt. Dies ist zum einen die Unterstützung unterschiedlicher Projekte durch ein umfangreiches Angebot an Routineprozessen im Bereich des Liquid und Library Handlings. Hierzu zählen Messreihen zur Charakterisierung des Wachstums bakterieller Kulturen und für das Monitoring von Promotor- und Enzymaktivitäten. Weitere Anwendungen sind das Handling von Klonbibliotheken, Transformations- und Transfektionsprotokolle für Modellbakterien und Hefe, sowie DNA-Assemblierungsprotokolle. Des Weiteren zählt zu diesem Anwendungsbereich die Probenvorbereitung für verschiedene Next Generation Sequencing Verfahren, sowie für Transkriptom- und Proteomanalysen. Diese Prozesse wurden zur Unterstützung verschiedener Projekte eingesetzt. Hierzu zählten beispielsweise Studien sRNA- und Second messenger-basierter Regulation. Zum anderen wurden Großprojekte durchgeführt, die die Entwicklung maßgeschneiderter komplexer Automationsprozesse erforderte. Hierzu zählen alle Stufen von Signature-tagged Mutagenese Experimenten von der Herstellung und Sortierung der Mutantenbibliotheken und der Mutantenpools für Kompetitionsexperimente bis zur Bestimmung der Insertionsstellen und der Amplifizierung der Sequenzbarcodes für deren Quantifizierung durch Next Generation Sequencing. Durch Screening einer Signature-tagged Transposon-Mutantenbibliothek wurden Gene identifiziert, die für die Besiedelung der Rhizosphäre von Wirts- und Nichtwirtspflanzen durch Sinorhizobium meliloti von Bedeutung sind. S. meliloti ist ein Vertreter der zu den α-Proteobakterien zählenden Rhizobien, die mit Leguminosen eine Symbiose einzugehen, in deren Verlauf die Bakterien molekularen Stickstoff fixieren. Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anpassung an die Rhizosphäre der Wirtspflanze vor dem Erwerb der Fähigkeit zur Symbiose stattgefunden hat und weisen auf eine frühe Koevolution der Rhizobien und ihrer Wirtspflanzen hin. Des Weiteren wurde eine lineare Abhängigkeit des prozentualen Anteils der Mutanten in der Rhizosphäre und in den gebildeten Wurzelknöllchen beobachtet. Dieser Zusammenhang unterstreicht die Bedeutung der frühen Interaktion mit der Pflanze für den späteren Erfolg bei der Besiedelung der Wurzelknöllchen. Effektorprotein werden von pathogenen Mikroorganismen in Wirtszellen transferiert, um diese zu manipulieren. In einem weiteren Großprojekt wurde die Wirkung der Produktion von etwa 300 Effektorproteinen in Hefemutanten im Hochdurchsatz getestet und mögliche Wechselwirkungen identifiziert, die Hinweise auf die Angriffsziele von Effektorproteinen im metabolischen Netzwerk der Wirtszelle lieferten. Diese werden in Folgeprojekten funktionell untersucht. Für Screening-Experimente mit Macrophagen wurden automatisierbare Protokolle zur Differenzierung, Transfektion, und Mikroskopie entwickelt. Legionella pneumophila ist ein Gram-negatives Bakterium, welches die potentiell tödliche Legionärskrankheit verursacht. Die entwickelten Protokolle wurden zum Screening des Effekts von miRNAs auf die Infektion von Macrophagen mit Legionella pneumophila eingesetzt. Die identifizierten miRNA-Kandidaten werden in Folgeprojekten funktionell charakterisiert. Für Anwendungen aus dem Bereich der Synthetischen Biologie wurden Prozesse für die Assemblierung modular aufgebauter Megaplasmidvektoren, zur Umorganisation und Reduktion bakterieller Genome und zur Charakterisierung der Aktivitäten synthetischer Schalter zur Kontrolle der Genexpression entwickelt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2016) Cyclic mononucleotide- and Clr-dependent gene regulation in Sinorhizobium meliloti. Microbiology. 162: 1840-1856
Krol E, Klaner C, Gnau P, Kaever V, Essen LO, Becker A
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(2017) A conserved α-proteobacterial small RNA contributes to osmoadaptation and symbiotic efficiency of rhizobia on legume roots. Environ Microbiol. 19:2661-2680
Robledo M, Peregrina A, Millán V, García-Tomsig NI, Torres- Quesada O, Mateos PF, Becker A, Jiménez-Zurdo JI
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(2017) A family of single copy repABC-type shuttle vectors stably maintained in the alphaproteobacterium Sinorhizobium meliloti. ACS Synth Biol. 6:968-984
Döhlemann J, Wagner M, Happel C, Carrillo M, Sobetzko P, Erb TJ, Thanbichler M, Becker A
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(2017) AraC-like transcriptional activator CuxR binds c-di-GMP by a PilZ-like mechanism to regulate extracellular polysaccharide production. Proc Nat Acad Sci USA. 114:E4822-E4831
Schäper S, Steinchen W, Krol E, Altegoer F, Skotnicka D, Søgaard-Andersen L, Bange G, Becker A
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(2017) Identification of insertion sites in a Sinorhizobium meliloti signature-tagged mini Tn5 transposon library using Next Generation Sequencing. J Biotechnol. pii:S0168-1656(17)30082-2
Serrania J, Johner T, Rupp O, Goesmann A, Becker A
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(2017) Monitoring succinoglycan production in single Sinorhizobium meliloti cells by Calcofluor white M2R staining and time-lapse microscopy. Carbohydrate Polymers. 181: 918-922
Jofré E, Liaudat JP, Medeot D, Becker A
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(2017) Regulation of polyhydroxybutyrate accumulation in Sinorhizobium meliloti by the trans-encoded small RNA MmgR. J Bacteriol. 199: e00776-16
Lagares A (Jr.), Borella GC, Linne U, Becker A, Valverde C
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(2017) Sinorhizobium meliloti YbeY is an endoribonuclease with unprecedented catalytic features, acting as silencing enzyme in riboregulation. Nucl Acids Res. 45:1371-1391
Saramago M, Peregrina A, Robledo M, Matos RG, Hilker R, Serrania J, Becker A, Arraiano CM, Jiménez-Zurdo JI
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(2017) Specificity traits consistent with legume-rhizobia coevolution displayed by Sinorhizobium meliloti rhizosphere colonization. Environ Microbiol. 19:3423-3438
Salas ME, Lozano MJ, Lopez JL, Draghi W, Serrania J, Torres Tejerizo GA, Albicoro FJ, Nilsson J, Pistorio M, del Papa MF, Parisi G, Becker A, Lagares A
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(2018) A novel methodology for characterizing cell subpopulations in automated time-lapse microscopy. Front Bioeng Biotechnol.
Hattab G, Wiemann V, Becker A, Munzer T, Nattkemper TW
