High Content Screening Microscope
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die High Content Screening (HCS) Mikroskopie ermöglicht, quantitativ Zellkulturen digital zu erfassen. Da dieses Gerät sehr schnell arbeitet, können so sehr viele Bilder in sehr kurzer Zeit aufgenommen werden. Die 96 Zellkulturbereiche einer 96-well Platte erfordert bei einer 10-fach Vergrößerung 64 zu photographierende Bereiche, die jeweils mit 4 unterschiedlichen Lichtanregungsfrequenzen illuminiert werden. Die sich daraus ergebenden rund 25000 Bilder werden in der Regel in nur 4 Stunden erfasst. Die softwarebasierte Einzelobjekterkennung von Objekten auf diesen digitalen Zellkulturphotos ermöglicht die unvoreingenommene und vollständig gleichmäßige quantitative Erfassung unterschiedlichster Parameter. Die Technik zeichnet sich zudem ferner dadurch aus, dass eine sehr große Anzahl unterschiedlicher Parameter gleichzeitig von jedem einzelnen Objekt erfasst werden kann (-> „High Content“ Mikroskop). Dies ermöglicht die multiparametrische Analyse. Diese Technik ermöglicht die umfassende Analyse von Zellkulturen und der Vorgänge darin auf der Basis sehr großer Datensätze. Die Größe des Datensatzes ist nicht Selbstzweck sondern die notwendige Grundlage, um mit hoher statistischer Signifikanz auch hochgradig heterogene Zellpopulationen zu analysieren. Mein Labor hat als erstes und bislang weitestgehend als einziges die HCS Mikroskopie für die Schmerzforschung an Kulturen von nozizeptiven Neuronen etabliert und eingesetzt. Diese Technik ist die zentrale Technik unseres Labors zur Untersuchung der Funktionsweise von afferenten nozizeptiven Neuronen. Es ermöglicht, erstmalig endogene Signalvorgänge in sehr großen Zahlen von adulten nozizeptiven Neuronen sichtbar zu machen. Während bislang vor allem Rezeptoren und sekretierte Neuropeptide untersucht wurden, ermöglicht uns dieser neue Ansatz die Analyse der intrazellulären Signalvorgänge. Das im Rahmen dieses Antrags erworbene Gerät hat uns ermöglicht, im Zeitraum von Mitte 2013 bis Mitte 2016 insbesondere das folgende Konzept durch Publikationen zu belegen: Nozizeptive Neuronen zeichnen sich durch die Exprimierung spezifischer intrazellulärer Signalkaskadenkomponenten aus. Ferner bewies der Ansatz bereits seine Nutzbarkeit auch in anderen thematischen Kontexten wie der Analyse von „Stress Granules“ und deren Regulation.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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5-Fluorouracil affects assembly of stress granules based on RNA incorporation, Nucleic Acids Res. 2014
Kaehler C, Isensee J, Hucho T, Lehrach H, Krobitsch S
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Pain modulators regulate the dynamics of PKA-RII phosphorylation in subgroups of sensory neurons, J Cell Sci. 2014
Isensee J, Diskar M, Waldherr S, Buschow R, Hasenauer J, Prinz A, Allgöwer F, Herberg FW, Hucho T
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Subgroup-elimination transcriptomics identifies signaling proteins that define subclasses of TRPV1-positive neurons and a novel paracrine circuit, PLoS One. 2014
Isensee J, Wenzel C, Buschow R, Weissmann R, Kuss AW, Hucho T
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The bromodomain protein BRD4 regulates splicing during heat shock, Nucleic Acids Res. 2016
Hussong M, Kaehler C, Kerick M, Grimm C, Franz A, Timmermann B, Welzel F, Isensee J, Hucho T, Krobitsch S, Schweiger MR,
