4D-Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop für in vivo time lapse imaging, PK, FRAP und TIRF
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die genaue Kenntnis der räumlichen und zeitlichen Verteilung von Proteinen und Nukleinsäuren erlaubt es, Aussagen über Funktion und Dynamik von Zellen zu machen. In den letzten Jahren wurden immer bessere optische Methoden entwickelt, um die Auflösung sowohl in räumlicher, wie zeitlicher Hinsicht zu verbessern. Parallel dazu sind eine Vielzahl von neuen Fluorophoren entwickelt und beschrieben worden, die verbesserte Eigenschaften haben. Neben deutlich erhöhten Photonenausbeuten, verbesserter Stabilität und geringerer Reifungsdauer, sind auch Fluorophore entwickelt worden, die durch gezielte Lasermanipulation ihre Fluoreszenzeigenschaften ändern. So werden zum Beispiel photo-konvertierbare Fluorophore eingesetzt, die für die Bestimmung von Proteindynamik und Lebensdauer eingesetzt werden. Die Dynamik von Proteinen in der Zelle kann auch durch das sogenannte „Fluorescence recovery after Photobleaching“ kurz FRAP analysiert werden. Die zeitliche Verfolgung der Proteindynamik erfolgt dabei in Zeitreihenaufnahmen. Eine technische Herausforderung ist hierbei, dass der Fokus über einen langen Zeitraum exakt gehalten wird. Für Zeitreihenaufnahmen mit wachsenden Zellen werden heute zumeist sogenannte Mikrofluidik-Kammern genutzt, bei denen Nährmedium konstant zugeführt werden kann und die Zellen in einer mikroskopisch kleinen Kammer wachsen, die auf dem Kreuztisch des Mikroskops fixiert ist. Mit dieser Technik lassen sich Wachstum und Proteindynamik unter verschiedenen Bedingungen (Einfluss von Stress, Nahrungszustand etc.) untersuchen. Das 4D-Weitfeldfluoreszenz-Mikroskop mit drei Laserlinien (405 nm, 488 m, und 561 nm) sowie einer „solid state“ Beleuchtungseinheit ist für die oben beschriebenen Anwendungen ideal geeignet. Es zeichnet sich durch eine hohe Präzision des Kreuztisches und eine gute Justierbarkeit der Laser aus. Zudem hat es einen sehr gut funktionierenden „Hardware Autofokus“, der auch lange andauernde Zeitreihenaufnahmen ermöglicht. Das Department I der Fakultät Biologie betreibt das Gerät zusammen mit anderen Lichtmikroskopen und ermöglicht den Zugang für unterschiedliche Nutzer aus der Genetik, Mikrobiologie, Pflanzenwissenschaften und Zellbiologie. Die Fragestellungen, die mit Hilfe dieses Mikroskops bearbeitet werden, reichen von der Analyse der Zellteilung bei Bakterien, der Lokalisation von Membranrezeptoren in Bakterien und Pflanzen, der Lokalisation von Proteinen in Parasiten, der Analyse von Magnetosomen, bis zu der Aufklärung von Proteinlokalisation in Chloroplasten bzw. Thylakoiden aus Cyanobakterien. Das 4D-Weitfeldfluoreszenz-Mikroskop hat seine Stärke besonders in der Visualisierung kleiner, lichtschwacher Proben. So ist z.B. die Kopienzahl von vielen Membranrezeptoren sehr gering und mit Standardverfahren sind diese nicht aufzulösen. Ebenso, sind einige Proteine der Zellteilungsmaschinerie nun in wenigen Kopien vorhanden. Durch die gleichbleibende Beleuchtung der Probe mit Hilfe des „solid state“ Moduls können diese Proteine auch in Zeitreihenaufnahmen gut visualisiert werden. Das Gerät ist aufgrund seiner vielfältigen Einsatzmöglichkeiten und der hohen Präzision und Stabilität der Standard für alle Anwendungen im Bereich Weitfeldmikroskopie im Department geworden. Konsequenterweise ist das Großgerät derzeit zu 100 % ausgelastet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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